Contrasting Isotope Effects on Amyloid Fibrillation in Water and Heavy Water
물과 중수에서 아밀로이드 섬유화에 나타나는 대조적인 동위원소 효과
- 주제(키워드) Amyloid , Water , Heavy Water , Hydrogen bonding , Hydrophobic interaction , Protein structure , Protein aggregation , Intrinsically disordered protein
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 김준곤
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 대학원 화학과
- 세부전공 분석화학전공
- 원문페이지 123 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000305767
- UCI I804:11009-000000305767
- DOI 10.23186/korea.000000305767.11009.0003283
- 본문언어 영어
초록/요약
Deuterium oxide (D2O) is widely substituted for H2O in spectroscopic studies due to its various advantages. However, despite these benefits, the isotope effects of D2O subtly yet significantly perturb protein structure and dynamics. In this dissertation, I investigate how the structural dynamics of proteins respond to solvent isotope substitution, focusing on two distinct structural classes: structured proteins and intrinsically disordered proteins (IDPs).Using time-resolved two-dimensional infrared (2D-IR) spectroscopy, I demonstrate that the fibrillation of insulin, a model structured protein, is delayed in D2O due to the stabilization of α-helical structures and formation of β-strand-rich dimeric intermediates. Further structural and thermodynamic analyses via small-angle X-ray scattering (SAXS), molecular dynamics (MD) simulations, and differential scanning calorimetry (DSC) confirm that D2O enhances the conformational stability of insulin and increases the energetic barrier to fibril nucleation. In contrast, ThT fluorescence assays, CD spectroscopy, and SAXS measurements reveal that IDPs, including α-synuclein, amyloid-β 1-42, and tau K18, exhibit significantly accelerated fibrillation in D2O. Ensemble-based modeling and umbrella sampling simulations show that this acceleration arises from thermodynamically favorable monomer binding and reduced nucleation energy barriers in heavy water. These findings demonstrate that isotope effects on protein aggregation are structure-dependent: D2O slows aggregation in structured proteins by stabilizing folded states, whereas it accelerates aggregation in IDPs by enhancing intermolecular interactions. This work provides new mechanistic insight into solvent-mediated protein aggregation and offers a critical framework for interpreting experiments in deuterated environments.
more초록/요약
물리학 및 생화학 분야에서 중수(D2O)는 다양한 분광학적 이점을 바탕으로 일반 물(H2O)을 대체하여 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고, D2O의 동위원소 효과는 단백질의 구조와 동역학에 미세하지만 유의미한 변화를 유발할 수 있다. 본 학위논문에서는 구조화된 단백질과 비정형 단백질(intrinsically disordered proteins, IDPs)의 두 가지 구조적 계열을 중심으로, 용매 동위원소 치환이 단백질의 구조 동역학에 미치는 영향을 규명하였다. Thioflavin T 형광 분석, 원편광이색성 분광법, 시간 분해 이차원 적외선 분광법을 통해, 구조화된 모델 단백질인 인슐린의 섬유화가 D2O 환경에서 지연됨을 확인하였으며, 이는 α-나선 구조의 안정화 및 β-가닥이 풍부한 이량체 중간체의 형성과 관련됨을 밝혔다. 이후 소각 X선 산란분석법, 분자동역학 시뮬레이션, 시차주사 열량측정법을 통해, D2O가 인슐린의 입체 구조를 안정화하고 섬유 핵형성에 필요한 에너지 장벽을 증가시킨다는 사실을 입증하였다. 반면, ThT 형광 분석, 원편광 이색성 분광법(Circular dichroism spectroscopy), SAXS 분석을 통해 알파시누클레인, 아밀로이드베타 1-42, 타우 K18과 같은 IDP들은 D2O에서 섬유화가 유의미하게 가속된다는 결과를 얻었다. 앙상블 기반 모델링과 umbrella sampling 시뮬레이션 결과, 이러한 섬유화 가속은 단량체 간 결합의 열역학적 안정성과 핵형성 에너지 장벽의 감소에 기인함을 확인하였다. 이러한 결과는 단백질 응집에 대한 동위원소 효과가 단백질의 구조적 특성에 따라 상이하게 나타남을 보여준다. 구조화된 단백질은 접힌 상태의 안정화로 인해 섬유화가 지연되는 반면, IDPs는 분자간 상호작용이 강화되어 섬유화가 촉진된다. 본 연구는 용매 기반 단백질 응집 메커니즘에 대한 새로운 분자적 통찰을 제공하며, 중수 환경에서 수행되는 생물물리학 실험 해석에 있어 중요한 분석적 기준을 제시한다.
more목차
ABSTRACT i
국문 초록 iii
PREFACE v
ACKNOWLEDMENTS vi
TABLE OF CONTENTS viii
LIST OF TABLES xi
LIST OF FIGURES xiii
NOMENCLATURE xix
CHAPTER 1. INTRODUCTION - 1 -
1.1 Amyloid Aggregation and the Role of Water - 1 -
1.2 Divergent Effects of D2O on Structured and Disordered Proteins - 2 -
1.3 Exploring Isotope Effect-Induced Changes in Protein Behavior: Roles of Hydrogen Bonding and Hydrophobic Microenvironments - 3 -
1.4 FIGURES - 5 -
1.5 TABLES - 6 -
CHAPTER 2. Direct Observation of Protein Structural Transitions Through Entire Amyloid Aggregation Processes in Water Using 2D-IR Spectroscopy - 7 -
2.1 INTRODUCTION - 7 -
2.2 RESULTS - 9 -
2.3 DISCUSSION - 12 -
2.4 EXPERIMENTAL SECTION - 13 -
2.5 FIGURES - 17 -
2.6 TABLES - 26 -
CHAPTER 3. Mechanistic Interpretation of Isotope Effects on Protein Fibrillation through Computational and Biophysical Analyses - 29 -
3.1 INTRODUCTION - 29 -
3.2 RESULTS - 30 -
3.3 DISCUSSION - 32 -
3.4 EXPERIMENTAL SECTION - 33 -
3.5 FIGURES - 36 -
3.5 TABLES - 43 -
CHAPTER 4. Accelerated amyloid aggregation dynamics of intrinsically disordered proteins in heavy water - 46 -
4.1 INTRODUCTION - 46 -
4.2 RESULTS - 47 -
4.3 DISCUSSION - 49 -
4.4 EXPERIMENTAL SECTION - 50 -
4.5 FIGURES - 53 -
4.6 TABLES - 59 -
CHAPTER 5. Theoretical Calculation of Thermodynamic and Kinetic Mechanisms of IDP Aggregation under Isotope Substitution - 61 -
5.1 INTRODUCTION - 61 -
5.2 RESULTS AND DISCUSSION - 62 -
5.3 DISCUSSION - 65 -
5.4 EXPERIMENTAL SECTION - 67 -
5.5 FIGURES - 68 -
5.6 TABLES - 73 -
Chapter 6. Conclusion - 74 -
REFERENCES - 76 -
APPENDICES - 84 -
A. Kinetics of Insulin Fibrillation at Various Conditions (Concentrations, Buffer, pH) - 84 -
B. FT-IR Spectroscopy of Insulin - 86 -
C. H-D Exchange of Insulin in D2O - 87 -
D. 2D-IR Spectroscopy of Insulin - 88 -
E. Denaturation of Insulin Structure - 92 -
F. Detailed Structural Analyses of IDPs. - 94 -
G. Diffusion of α-Synuclein in H2O and D2O - 99 -
H. Calculation of the Rate of Nucleation - 100 -
