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Applications of Terahertz Spectroscopy in Biomolecular Recognition

  • Yeonkyung Lee (이연경, 대학원 바이오마이크로시스템기술협동과정 바이오마이크로시스템기술전공)

초록/요약

For the survival of living organisms, maintaining biological homeostasis is essential. Proteins are the core molecular machine which regulate this process, therefore, understanding structure, functional roles and subsequent malfunctions of them are closely related to various diseases. This highlights the importance of elucidating the structure and function of proteins to better understand and combat such diseases. Understanding how proteins obtain their structure as a result of folding, and function by interacting with other molecules is noteworthy for both fundamental biology and for the development of diagnostics and therapeutics tools. In recent decades, there has been significant advances in protein characterization due to the development of a wide range of analytical and spectroscopic techniques. In addition, biosensor-based diagnostic approaches have also shown remarkable progress in the detection of diseases associated with proteins by targeting disease-specific biomarkers. However, as the complex relationships between biological processes and disease mechanisms are not yet fully understood, there is a growing need for diagnostic tools and clinical applications that go beyond simple detection and rapid, accurate, and accessible analysis with detailed information on the interactions among biological components. To overcome this limitation, this thesis focuses on developing novel biosensors using terahertz time-domain spectroscopy (THz-TDS), which is a promising tool for the detection of target molecules, based on the intermolecular interactions between biomolecules and THz wave. THz-TDS has ability to detect collective biomolecular interactions and biological changes in real-time, as it offers label-free, non-invasive, and highly sensitive detection. In contrast to the traditional biosensors, which simply detect target biomolecules, biosensors based on THz-TDS provides further potential in studying delicate biological interactions. This research focuses on two key disease systems: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) and psychiatric disease related G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) signaling, which represent complex formation and dynamic equilibrium kinetics, respectively. The study begins with the background information the potential of THz-TDS as a biosensing platform by discriminating simple biomolecules, SARS-CoV-2-related peptides. This platform is further extended to more complex systems based on antigen-antibody interactions, thereby validating the versatility of this approach. Finally, an advanced platform, designed to target weaker intermolecular interactions is described. By investigating the more intricate biological system of GPCR-mediated signaling, this study successfully demonstrates the potential of THz-TDS as a biosensor to detect subtle biomolecular dynamics. With the demand for more accurate, rapid, and simply accessible diagnostic technologies grows, THz biosensors provide a novel platform with broad applicability based on physicochemical sensing. This thesis emphasizes that the potential of THz biosensors further advancements in biomedical, therapeutic and pharmaceutical fields including drug development and screening, thus bridging the gap between fundamental biomolecular studies and practical biosensing applications.

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초록/요약

항상성 유지는 생물체의 생존에 필수적이며, 단백질은 이 과정을 조절하는 핵심 분자 기계이다. 따라서 단백질의 구조와 기능은 항상성 유지의 핵심 요소이며, 단백질의 오작동은 다양한 질병과 밀접하게 관련되어 있다. 이는 생명 현상과 질병을 더 잘 이해하고 예방하기 위해, 생체 분자의 구조와 기능을 분석하는 것이 중요하다는 것을 의미한다. 단백질이 어떻게 올바른 구조로 접히며, 다른 분자들과 상호작용하는지를 탐구하는 것은 생물학 뿐만 아니라 진단 및 치료법 개발에도 매우 중요하다. 최근 수십 년 동안 다양한 분석 및 분광 기술의 발달로 단백질 구조와 기능을 분석하는 방법이 크게 발전해왔고, 바이오센서 기반 진단 접근법을 통해 해당 질병의 바이오마커를 표적으로 삼아 단백질 오작동과 관련된 질병을 감지하는 데에도 현저한 진전을 보였다. 하지만 생물학적 과정과 질병 메커니즘 간의 복잡한 관계가 아직 완전히 이해되지 못함에 따라, 단순 탐지를 넘어 임상 적용을 위한 생체 구성 요소들 간의 상호작용과 관련된 정보에 신속하고 정확하며, 사용에도 용이한 분석법을 제공하는 진단 도구에 대한 필요성이 커지고 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 본 논문은 테라헤르츠 시간 영역 분광법을 활용한 바이오센서 개발에 초점을 맞추고 있으며, 이는 생체 분자 정보 분석을 기반으로 표적 분자를 탐지하는 유망한 도구가 될 수 있다. 생체 분자 분석을 위한 기존 방법들과 달리, 테라헤르츠 시간 영역 분광법은, 비표지, 비침습적이며 고감도 탐지를 가능하게 하므로, 생체 분자 인식 및 생물학적 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있다. 이는 테라헤르츠 시간 영역 분광법이 섬세한 생물학적 상호작용 연구를 위한 바이오센서로 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 본 연구는 각각 복합체 형성과 동적 평형 운동학을 대표하는 두 가지 주요 질병 시스템, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2 및 정신 질환 관련 G 단백질 결합 수용체의 신호 전달에 초점을 맞추고 있다. 먼저, 본 연구에 필요한 기본 지식과, 실험 세부 사항에 대한 설명을 바탕으로, 단순 생체 분자인 코로나바이러스 관련 펩타이드를 구별함으로써 테라헤르츠 시간 영역 분광법이 바이오센싱 플랫폼으로서 가질 수 있는 잠재력을 보여준다. 또한, 더 복잡한 시스템인 항원-항체 반응으로 확장되어, 본기술의 바이오센서로서의 적용 가능성과, 범용성을 검증했다. 더 나아가, 약한 분자간 상호작용을 표적으로 삼도록 설계된 발전된 플랫폼에 대해 설명하며, G 단백질 결합 수용체 매개 신호 전달이라는 더 복잡한 생물학적 시스템을 사용하여, 테라헤르츠 시간 영역 분광법이 미묘한 생체 분자 역학을 감지할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었다. 보다 정확하고 신속하며 접근이 용이한 탐지 기술에 대한 수요가 증가함에 따라, 테라헤르츠 바이오센서는 물리화학적 감지 기반의 넓은 적용 가능성을 지닌 새로운 플랫폼을 제공한다. 본 논문은 테라헤르츠 바이오센서가 질병 진단뿐만 아니라 분자간 상호작용 기반의 진단, 즉, 바이러스 감염 및 정신 질환과 같은 생의학 및 치료, 그리고 신약 개발과 스크리닝을 포함한 제약 분야에서의 획기적인 발전 가능성을 보였다. 이 플랫폼은 기본적인 생체 분자 연구와 바이오센싱 사이의 간극을 해소하는 역할을 할 것이다.

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목차

TABLE OF CONTENTS
ABSTRACT i
국문 초록 iii
TABLE OF CONTENTS vi
LIST OF TABLES ix
LIST OF FIGURES x
ABBREVIATIONS xvii
CHAPTER 1. INTRODUCTION 1
1.1 Proteins 2
1.1.1 Biological Roles 2
1.1.2 Structural Formation and Folding 3
1.1.3 Binding Kinetics 4
1.1.4 Significance of Protein Analysis 5
1.2 Protein Analysis and Detection 6
1.2.1 Structural and Functional Characterization 6
1.2.2 Protein-Based Biosensor Platforms 8
1.2.3 Limitations of Current Approaches 10
1.3 Terahertz Time-Domain Spectroscopy in Biomolecular Analysis 11
1.3.1 Spectral Characteristics of Terahertz Radiation 11
1.3.2 Physical Principles and Signal Response 14
1.3.3 Biosensing Applications 15
1.4 Research Objectives 16
CHAPTER 2. EXPERIMENTAL PROCEDURES 18
2.1 Reagents and Instruments 18
2.1.1 Surface Characterization 18
2.1.2 Protein Purification and Structural Analysis 19
2.2 Fabrication and Functionalization of Metamaterial 22
2.2.1 Fabrication of Nanoslot Arrays 22
2.2.2 Functionalization and Biomolecule Immobilization 25
2.3 Immunoassays 28
2.3.1 Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis 28
2.3.2 Western Blot 29
2.3.3 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 30
2.4 Terahertz Measurements 31
2.4.1 Transmittance Mode 31
2.4.2 Reflectance Mode 33
CHAPTER 3. APPLICATION TO COMPLEX FORMATION KINETICS 36
3.1 Discrimination of SARS-CoV and SARS-CoV-2 derived peptides 38
3.1.1 Preparation of SARS-CoV-2 related peptides 38
3.1.2 Background Optical Properties of Nanoslot Metamaterial 42
3.1.3 Target Molecule Discrimination using THz measurements 47
3.2 Development of Target- and Site-selective Metamaterial 57
3.2.1 Surface Functionalization and Protein Immobilization 57
3.2.2 Immunoassay-Based Validation of Surface Functionalization 58
3.2.3 Target-Selective Detection via Antigen-Antibody interaction 60
3.2.4 Serological Analysis using Clinical Samples 63
3.3 Conclusion 70
CHAPTER 4. APPLICATIONS TO DYNAMIC EQUILIBRIUM KINETICS 72
4.1 Production and Purification of Serotonin Receptor Nanodiscs 74
4.1.1 Gene Preparation 74
4.1.2 Receptor Protein Expression in Escherichia coli 77
4.1.3 Solubilization and Purification 78
4.1.4 Membrane Scaffold Protein Expression and Purification 81
4.1.5 Functional Reconstitution and Nanodisc Assembly 85
4.2 Characterization of Reconstituted Receptor Nanodiscs 88
4.2.1 Morphological Analysis 88
4.2.2 Functional Analysis 89
4.2.3 Spectrophotometric Detection of Serotonin 91
4.2.4 Conformational Change Analysis via Molecular Dynamics Simulation 93
4.2.5 Receptor-Ligand Binding Analysis 95
4.3 Terahertz Measurements 98
4.4 Conclusion 103
CHAPTER 5. CONCLUSION 105
REFERENCES 107
LISTS OF PUBLICATIONS 135

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