PC-3 유래 암줄기세포 유사세포의 특성에 대한 DRD4 의 기능 규명
Elucidation of DRD4's function on the characteristics of PC-3-derived cancer stem cell-like cells
- 주제(키워드) 도파민 , 도파민 수용체 , 암줄기세포 , DRD4 , 전립선암 , PC-3 세포 , prostate cancer , cancer stem cells , dopamine , dopamine receptor , DRD4 , PC-3 cell
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 박성규
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 대학원 약학과
- 원문페이지 87 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000290612
- UCI I804:11009-000000290612
- DOI 10.23186/korea.000000290612.11009.0001896
- 본문언어 한국어
초록/요약
전립선암은 세계에서 두번째로 흔한 암으로, 남성의 주요 암 사망 원인이다. 이런 전립선암은 발생률이 높은 만큼 조기 진단과 치료가 중요하다. 따라서 다양한 암 종에 따라 여러 치료법이 개발되어왔는데, 이 치료법 중 하나는 암줄기세포의 특성 상실을 유도하여 암을 치료하는 것이다. 최근 전립선암의 암줄기세포가 암의 성장, 전이, 약물 내성, 재발에 관련이 있다는 보고에 따라 본 연구에서는 사전 연구를 통해 확립된 인체 유래 전립선암세포인 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포(PC-3-derived cancer stem cell-like cell)을 연구하였다. 또한 다른 사전 연구를 통해 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포의 특성 상실과 도파민 수용체 억제제가 관련이 있다는 것을 알 수 있었다. 이를 토대로 본 연구에서는 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포에서 Dopamine receptor 4(DRD4)억제제를 사용하여 PC-3유래 암줄기세포 유사세포의 특성에 대한 DRD4의 기능을 확인해보았다. PC-3 유래 암줄기세포 유사세포에 길항제와 siRNA를 이용한 DRD4억제제를 처리하여 DRD4를 억제하였을 때 암줄기세포 유사세포의 특성에서의 변화 확인을 위해 형태 변화 관찰, 세포 수 분석, 세포 이동성 분석을 진행하였다. DRD4길항제인 PD 168568 dihydrochloride 혹은 DRD4 siRNA로 DRD4를 억제하였을 때 억제제의 농도가 증가함에 따라 형태 변화의 정도가 증가하고, 세포 수 및 세포의 이동성이 감소하는 것을 확인하였다. DRD4 siRNA transfection에 의해 PC-3유래 암줄기세포 유사세포에서 DRD4가 knockdown되었는지는 DRD4 mRNA 발현과 DRD4 protein 발현을 통해 확인하였다. 이를 통해 DRD4가 PC-3유래 암줄기세포 유사세포에서 DRD2보다는 약하지만 암줄기세포의 특성을 상실시키고 분화를 유도하는 것을 확인하였다. 또한 PC-3유래 암줄기세포 유사세포에 DRD4길항제를 처리한 후 세포 내 신호 전달 경로의 변화를 분석하였을 때, 분석된 신호전달물질들 중 cAMP response element-binding protein(CREB)의 인산화가 PD 168568 dihydrochloride에 의해 가장 크게 변화한 것으로 보아 CREB의 인산화가 DRD4 억제에 의한 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포의 특성 변화에 관련되는 주요 신호전달물질의 하나 일 것으로 기대된다. DRD4와 다른 도파민 수용체 아형의 상호작용이 있을 수 있기 때문에, DRD4 길항제와 다른 도파민 수용체 아형의 길항약과 병용 처리 효과를 분석하였다. DRD4와 DRD3의 길항제를 PC-3유래 암줄기세포 유사세포에 병용하여 처리하였을 때 가장 큰 폭으로 성장이 억제됨을 확인하였다. DRD4 길항제인 PD 168568 dihydrochloride와 DRD3 길항제인 PG 01037 dihydrochloride를 PC-3유래 암줄기세포 유사세포에 처리하고 세포 형태 변화, 세포 수 분석, 세포 이동성을 분석하였다. PD 168568 dihydrochloride와 PG 01037 dihydrochloride를 각각 처리하였을 때보다 이들을 병용 처리하였을 때 형태 변화의 정도가 증가하고, 세포 수와 세포의 이동성은 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포의 사멸을 유도하는지 확인하기 위해 진행한 세포자멸사 분석에서, PD 168568 dihydrochloride와 PG 01037 dihydrochloride이 PC-3유래 암줄기세포 유사세포에서 유의미한 세포 사멸을 유도하지 않는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 DRD4와 DRD3가 PC-3유래 암줄기세포 유사세포의 특성 상실과 연관되어 있지만, 세포자멸사와 관련될 가능성은 적은 것으로 판단된다. 본 연구에서는 DRD4의 억제가 PC-3유래 암줄기세포 유사세포의 특성 상실과 연관되어 있음을 확인할 수 있었으며, DRD3와의 상호작용이 암줄기세포의 특성 변화를 더 큰 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다. 추가 연구를 통해 PC-3유래 암줄기세포 유사세포의 특성 상실에 대한 도파민 수용체 억제의 작용 기전을 보다 명확히 파악할 경우 전립선암 치료제 개발을 위한 새로운 아이디어를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
more초록/요약
Prostate cancer represents the second most prevalent form of cancer globally and is the primary cause of cancer-related mortality in males. Given its high prevalence, prompt diagnosis and treatment are of paramount importance. A number of therapeutic modalities have been developed for different cancer types, including the induction of cancer stem cell properties loss as a means of cancer treatment. In light of recent reports indicating the involvement of cancer stem cells in prostate cancer growth, metastasis, drug resistance, and recurrence, this study investigated PC-3-derived cancer stem cell-like cells, a human-derived prostate cancer cell line established through previous studies. Moreover, prior research has indicated that dopamine receptor inhibitors are linked to the loss of characteristics observed in PC-3-derived cancer stem cell-like cells. In this study, we employed dopamine receptor 4 (DRD4) inhibitors in PC-3-derived cancer stem cell-like cells to ascertain the role of DRD4 in regulating the properties of PC-3-derived cancer stem cell-like cells. PC-3-derived cancer stem cell-like cells were treated with DRD4 inhibitors using antagonists and siRNA to inhibit DRD4. Subsequently, morphological changes, cell number analysis, and cell migration assays were conducted to identify alterations in the characteristics of cancer stem cell-like cells. Inhibition of DRD4 with the antagonist PD 168568 dihydrochloride or DRD4 siRNA resulted in a dose-dependent increase in morphological changes, accompanied by a decrease in cell number and cell mobility. The knockdown of DRD4 in PC-3-derived cancer stem cell-like cells was confirmed by demonstrating a reduction in DRD4 mRNA and protein expression following transfection with DRD4 siRNA. Our findings indicate that DRD4 plays a role in the loss of cancer stem cell properties and differentiation in PC-3-derived cancer stem cell-like cells, although to a lesser extent than DRD2. Moreover, an examination of the alterations in intracellular signaling pathways following the treatment of PC-3-derived cancer stem cell-like cells with DRD4 antagonists revealed that the phosphorylation of cAMP response element-binding protein (CREB) exhibited the most pronounced change. The results of the analysis indicated that PD 168568 dihydrochloride was among the signaling pathways that exhibited the most significant alteration, suggesting that CREB phosphorylation may be a crucial signaling pathway involved in the changes observed in the properties of PC-3-derived cancer stem cell-like cells due to DRD4 inhibition. Given the potential for interactions between DRD4 and other dopamine receptor subtypes, we conducted an analysis to assess the effects of combining DRD4 antagonists with antagonists of other dopamine receptor subtypes. The greatest inhibitory effect on growth was observed when antagonists of DRD4 and DRD3 were administered in combination with PC-3-derived cancer stem cell-like cells. PC-3-derived cancer stem cell-like cells were treated with PD 168568 dihydrochloride, a DRD4 antagonist, and PG 01037 dihydrochloride, a DRD3 antagonist. Subsequent analysis was conducted to assess changes in cell morphology, cell counting, and cell migration. The combined treatment of PD 168568 dihydrochloride and PG 01037 dihydrochloride was observed to result in a greater extent of morphological changes, a decreased cell number, and a reduction in cell mobility, when compared to the treatment of PD 168568 dihydrochloride and PG 01037 dihydrochloride individually. Moreover, the apoptosis assay was conducted to ascertain whether the agents induced cell death. The results demonstrated that PD 168568 dihydrochloride and PG 01037 dihydrochloride did not induce significant cell death in PC-3-derived cancer stem cell-like cells. These findings suggest that DRD4 and DRD3 may be associated with the loss of properties of PC-3-derived cancer stem cell-like cells, but are unlikely to be involved in apoptosis. The findings of this study indicate that the inhibition of DRD4 is associated with the loss of properties observed in PC-3-derived cancer stem cell-like cells. This suggests that the interaction between DRD4 and DRD3 may have a greater effect on the changes observed in cancer stem cell properties. Further studies are required to elucidate the mechanism of action of dopamine receptor inhibition on the loss of properties of PC-3-derived cancer stem cell-like cells. This may facilitate the development of novel prostate cancer therapeutics.
more목차
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 실험방법 8
파트 1. PC-3 유래 암줄기세포 유사세포에서의 DRD4 억제효과 8
2.1 실험 재료(Materials) 8
2.2 실험 방법(Method) 8
2.2.1 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포 배양 8
2.2.2 도파민 수용체 길항제를 이용한 세포 성장 억제 분석 9
2.2.3 DRD4 길항제를 이용한 세포 형태 변화 확인 10
2.2.4 DRD4 길항제를 이용한 세포 수 분석 10
2.2.5 DRD4 길항제를 이용한 세포 이동능 분석 11
2.2.6 DRD4 길항제를 이용한 Western blot 분석 11
2.2.7 DRD4 siRNA transfection 12
2.2.8 DRD4 siRNA transfection 후 세포 형태 변화 확인 12
2.2.9 DRD4 siRNA transfection 후 세포 수 분석 13
2.2.10 DRD4 siRNA transfection 후 세포 이동능 분석 13
2.2.11 DRD4 siRNA transfection 후 RT-qPCR을 이용한 mRNA 발현 분석 13
2.2.12 DRD4 siRNA transfection 후 Western blot을 이용한 protein 발현 분석 16
2.2.13 통계 분석 17
파트 2. PC-3 유래 암줄기세포 유사세포에서의 DRD4와 DRD3 길항제의 병용효과 18
2.1 실험 재료(Materials) 18
2.2 실험 방법(Method) 20
2.2.1 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포 배양 20
2.2.2 DRD4 길항제와 도파민 수용체 길항제병용 시 세포 성장 억제 분석 20
2.2.3 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용 시 세포 형태 변화 확인 21
2.2.4 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용 시 세포 수 분석 21
2.2.5 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용 시 세포 이동능 분석 22
2.2.6 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용 시 세포자멸사 분석 22
2.2.7 통계 분석 23
Ⅲ. 결과 및 고찰 25
파트 1. PC-3 유래 암줄기세포 유사세포에서의 DRD4 억제효과 25
3.1 도파민 수용체 길항제가 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포의 성장에 미치는 영향 25
3.2 DRD4 길항제가 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포의 형태 변화에 미치는 영향 28
3.3 DRD4 길항제로 인한 PC-3 유래 암줄기세포 유사세포 수 변화 분석 30
3.4 DRD4 길항제가 PC-3유래 암줄기세포 유사세포의 이동성에 미치는 영향 32
3.5 DRD4 길항제가 PC-3유래 암줄기세포 유사세포 내 신호전달에 미치는 영향 35
3.6 DRD4 siRNA knockdown 이 PC-3유래 암줄기세포 유사세포의 형태 변화에 미치는 영향 39
3.7 DRD4 siRNA knockdown으로 인한 PC-3유래 암줄기세포 유사세포 수 변화 분석 42
3.8 DRD4 siRNA knockdown이 PC-3유래 암줄기세포 유사세포의 이동성에 미치는 영향 44
3.9 DRD4 siRNA knockdown 후 PC-3유래 암줄기세포 유사세포에서 DRD4 발현 확인 47
파트 2. PC-3 유래 암줄기세포 유사세포에서의 DRD4와 DRD3 길항제의 병용효과 51
3.1 DRD4 길항제와 도파민 수용체 아형의 길항제 병용처리가 세포 성장에 미치는 영향 51
3.2 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용처리 시 세포 형태 변화에 미치는 영향 55
3.3 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용처리 시 세포 수 분석 57
3.4 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용처리가 세포의 이동성에 미치는 영향 59
3.5 DRD4 길항제와 DRD3 길항제 병용처리에 의한 세포 사멸 유도 분석 62
Ⅳ. 결론 65
Ⅴ. 참고문헌 69
