Label-Free Biomolecular Analysis and Characterization of Adipocytes using FTIR Spectroscopy
- 주제(키워드) FTIR spectroscopy , adipocytes , obesity , beige adipocytes
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 고용
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 8
- 학위구분 박사
- 학과 대학원 생명공학과
- 세부전공 분자생체공학
- 원문페이지 163 p
- UCI I804:11009-000000277185
- DOI 10.23186/korea.000000277185.11009.0000122
- 본문언어 영어
초록/요약
Recently, due to the increase in obesity-related diseases and adipose-derived stem cells for autologous stem cell therapy, the need for research on adipocytes is in greater demand. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy is a technique emerging in biomedical diagnostics. In contrast to current molecular biological techniques that use dyes or stains for microscopic observation, FTIR spectroscopy using computer technology could provide label-free biomolecular analysis and recognize important spectral biomarkers. This study was conducted to investigate the developmental characteristics of mouse adipocytes and to identify selectively mouse white and brown adipocytes through FTIR spectroscopy. For the developmental characterization of adipocytes, cells and conditioned media of white and brown adipocytes were respectively collected and analyzed. A higher amide I/amide II ratio was observed in the conditioned medium of brown adipocytes than in that of white adipocytes, indicating differences in secretory protein profiles. In contrast, an amide I/amide II ratio was higher in white adipocytes than in brown adipocytes, and mature adipocytes have higher lipid amounts than preadipocytes. Lipid acyl chain length was the longest in white adipocytes. These differences suggested that FTIR spectroscopy can be used to characterize developmental stages and/or types of adipocytes. To identify the possibility of selectively classifying adipose-derived stem cells, Infrared spectra were obtained in cells before/after white/brown adipocyte differentiation using FTIR spectroscopy and then analyzed by the principal component analysis method. With the use of infrared spectra and principal component analysis techniques, the data showed that it was possible to discriminate between adipocytes. Also, to confirm scalability with human adipocytes, we aimed to identify the browning of human white adipocytes (beige adipocytes) using partial least squares regression (PLSR), infrared spectral biomarkers, and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) with FTIR spectroscopy instead of molecular biology. Beige adipocytes are a type of fat cell that can generate heat, which can help to burn calories and reduce body weight. PLSR helps distinguish human beige adipocytes treated with norepinephrine and rosiglitazone. When PLSR was based on the selected regions of 3997–3656 and 1618–938 cm−1, PLSR achieved an R2 of cross-validation of 88.95, a root mean square error of cross-validation (RMSECV) of 2.13, and a ratio performance deviation (RPD) of 3.01. Infrared spectral biomarkers [1635 cm−1 (β-sheet amide I), 879–882, 860–3 cm−1 (A-form helix), and 629–38 cm−1 (OH out-of-plane bending)] were identified in human beige adipocytes based on spectral differences between human beige adipocytes and human white adipocytes, principal component analysis-linear discriminant analysis (PCA-LDA) cluster vector, U-test, and Fisher’s score per wavenumber. PLS-DA yielded a useful classification of adipocytes and expression distribution of adipogenesis genes in adipocytes. The present study employed a predictive model of PLSR and investigated alterations in a specific spectral peak to discern beige adipocytes. The findings suggested that PLSR has the potential to identify prospective drug candidates capable of inducing adipocyte browning, with a predicted value exceeding 70 indicating a positive influence. Moreover, the spectral biomarkers discovered in this investigation could potentially be associated with genes, particularly thermogenic markers such as uncoupling protein 1 (UCP1), which are closely linked to adipocyte browning. Additionally, this study demonstrated the feasibility of employing spectral variables for lipidomics. Furthermore, the genes predicted by PLS-DA exhibited a similar pattern to those identified through quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis, underscoring the notion that FTIR spectra harbor distinctive information pertaining to transcriptional activities. Hence, this research proposes the utilization of PLSR, infrared spectral biomarkers, and PLS-DA in conjunction with FTIR spectroscopy as efficacious methodologies for discerning distinct biological activities within constrained settings. Consequently, the findings of this study indicate that the integration of FTIR spectroscopy and computer technology holds promise for the identification of pharmaceutical compounds conducive to weight loss. Furthermore, these approaches demonstrate cost-effectiveness and obviate the need for labeling, thereby endowing researchers with invaluable tools for their investigative and therapeutic endeavors.
more초록/요약
최근 비만 관련 질병의 증가와 자가 줄기세포 치료를 위한 지방 유래 줄기세포에 대한 연구의 필요성이 증가하고 있다. FTIR (Fourier Transform InfraRed) 분광기는 생명 의학 진단에서 새로운 기술이다. 현재의 분자생물학 기술에서는 현미경 관찰을 위해 염료나 시약을 사용하는 것과 달리, FTIR 분광기는 컴퓨터 기술과 결합하여 레이블이 없는 생체 분자 분석을 제공하고 중요한 적외선 스펙트럼 영역의 바이오 마커를 인식할 수 있다. 본 연구는 마우스 지방세포의 발달 특성을 조사하고 FTIR 분광기를 사용하여 마우스 백색 및 갈색 지방세포를 선택적으로 식별하기 위해 수행되었다. 지방세포의 발달 특성화를 위해 백색지방세포와 갈색지방세포의 세포와 세포 배양된 조건배지를 각각 수집하여 분석하였다. 갈색지방세포의 배양된 조건배지에서 백색지방세포의 배양된 조건배지보다 amide I/amide II 비율이 더 높게 관찰되었으며, 이는 분비 단백질 프로파일의 차이를 나타난다. 대조적으로, amide I/amide II 비율은 갈색 지방 세포보다 백색 지방 세포에서 더 높았고, 분화된 지방 세포는 분화 전 지방 세포보다 지질 함량이 더 높았다. 지방 아실 사슬의 길이는 백색 지방 세포에서 가장 길었다. 이러한 차이는 FTIR 분광법이 지방 세포의 발달 단계 및/또는 유형을 특성화 하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 지방세포의 유형별 선택적 분류 가능성을 확인하기 위해 FTIR 분광기를 사용하여 백색/갈색 지방세포 분화 전/후의 세포에서 FTIR 분광 스펙트럼을 획득한 후 주성분 분석법으로 분석하였다. 모든 데이터는 주성분 분석 기법을 통해 적외선 분광 스펙트럼 분석에서 지방세포 간의 구별이 가능함을 나타냈다. 또한 휴먼 지방세포로의 확장성을 확인을 위해 분자생물학 기법 대신 FTIR 분광법으로 부분 최소 제곱 회귀(PLSR), 적외선 스펙트럼 바이오마커, 그리고 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)을 사용하여 휴먼 백색 지방세포의 갈변(베이지 지방세포)을 식별하는 것을 목표로 연구했다. 베이지 지방 세포는 열을 발생시킬 수 있는 지방 세포의 한 종류로 칼로리 소비와 체중 감량에 도움을 줄 수 있다. PLSR은 노르에피네프린과 로시글리타존으로 유도된 휴먼 베이지 지방 세포를 구별했다. PLSR은 선택된 영역인 3997–3656 및 1618–938 cm-1에서 교차 검증의 R2 88.95, 교차 검증의 루트 평균 제곱 오차(RSECV) 2.13, RPD 3.01을 달성했다. 적외선 스펙트럼 바이오 마커 [1635 cm-1 (β-시트amide I), 879–882, 860–3 cm-1 (A형 나선), 629–38 cm-1 (OH 평면 외 굽힘)]는 휴먼 베이지 지방세포와 휴먼 백색 지방세포 사이의 스펙트럼 차이, 주성분 분석-선형 판별 분석(PCA-LDA), 군집 벡터, U-검정, 파수당 피셔 점수를 통해 휴먼 베이지 지방세포에서 확인되었다. PLS-DA는 지방세포 타입 구별이 가능했고 지방세포에서 지방 형성 유전자의 발현과 유사한 경향은 나타냈다. 본 연구는 PLSR의 예측 모델을 활용하여 특정 스펙트럼 피크의 변화를 탐지하여 베이지 지방세포를 식별하는 데 사용되었다. 연구 결과, PLSR은 지방세포 갈색화를 유도할 수 있는 약물 후보물질을 식별하는 데에 유용하며, 예측 값이 70 이상인 경우 긍정적인 영향을 나타낸다. 또한, 이 연구에서 발견된 스펙트럼 바이오 마커는 유전자와 연관성을 갖을 수 있으며, 특히 지방세포 갈색화와 관련된 열원성 마커(UCP1 등)와 관련이 있을 것으로 예상된다. 이 연구는 스펙트럼 변수를 활용한 지질체 분석의 가능성을 보여줄 뿐만 아니라, PLS-DA로 예측된 유전자는 qRT-PCR 분석 결과와 유사한 경향을 나타내었으며, FTIR 스펙트럼이 전사 활동의 지문 정보를 포함하고 있다는 가능성을 시사한다. 따라서, 이 연구에서는 FTIR 분광기와 함께 PLSR, 적외선 스펙트럼 바이오 마커, 그리고 PLS-DA를 사용하여 제한된 환경에서 특정 생물학적 활동을 식별하는 효과적인 도구로 제안한다. 이 연구는 FTIR 분광기과 컴퓨터 기술을 활용하여 체중 감량에 도움이 되는 약물을 식별하는 데 사용될 수 있으며, 비용 효율적이며 시약을 필요로 하지 않는 특징으로 연구자들에게 가치 있는 도구로 활용될 수 있다.
more목차
ABSTRACT i
국문 초록 iv
PREFACE viii
ACKNOWLEDGMENTS ix
TABLE OF CONTENTS x
LIST OF TABLES xiv
LIST OF FIGURES xv
LIST OF ABBREVIATIONS xix
CHAPTER I INTRODUCTION 1
CHAPTER II LITERATURE REVIEW 4
2.1 FTIR microscopy 5
2.1.1 Electromagnetic waves and InfraRed 5
2.1.2 Radiation and matter interaction: molecular vibration 5
2.1.3 Infrared spectroscopy 9
2.1.4 Data Assessment: Qualitative/Quantitative Analysis 13
2.1.5 Concept and Application of Infrared Microscopy 16
2.1.6 Structure of Infrared Microscopy 18
2.1.7 Fourier transform infrared image 20
2.1.8 Infrared Spectrum Data Analysis and Application 24
2.1.9 The Future of Infrared Microscopy 30
2.2 Adipose Tissue 32
2.2.1 Adipocytes 32
2.2.2 Adipocyte differentiation 34
2.2.3 Structure and Physiology of White Adipose Tissue 35
2.2.4 Regulation of white fat formation of White Adipose Tissue 37
2.2.5 Structure and Physiology of Brown Adipose Tissue 39
2.2.6 Regulation of brown fat formation of Brown Adipose Tissue 40
2.2.7 Analysis of Characteristics in Adipocytes 41
CHAPTER III IDENTIFICATION OF BIOCHEMICAL DIFFERENCES IN WHITE AND BROWN ADIPOCYTES USING FTIR SPECTROSCOPY 45
3.1 Introduction 46
3.2 Materials and Methods 47
3.2.1 Culture and Differentiation 47
3.2.2 Oil-Red-O Staining 48
3.2.3 Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction Analysis 48
3.2.4 Preparation and Collection of Infrared Spectroscopy Spectra 49
3.2.5 Statistical Analysis 49
3.3 Results 49
3.3.1 Differentiation of 3T3-L1 White Preadipocytes and Immortalized Brown Preadipocytes 49
3.3.2 FTIR Spectroscopy Spectra of Adipocyte Conditioned Media 50
3.3.3 FTIR Spectroscopy Spectra of Adipocytes 53
3.3.4 Discrimination of Adipocytes 55
3.4 Discussion 56
CHAPTER IV IDENTIFICATION OF BROWNING IN HUMAN ADIPOCYTES BY PARTIAL LEAST SQUARES REGRESSION (PLSR), INFRARED SPECTRAL BIOMARKERS, AND PARTIAL LEAST SQUARES DISCRIMINANT ANALYSIS (PLS-DA) USING FTIR SPECTROSCOPY 62
4.1 Introduction 63
4.2 Materials and Methods 65
4.2.1 Human Adipose-Derived Stem Cell Culture and Differentiation 65
4.2.2 Oil-Red-O Staining 66
4.2.3 Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) Analysis 66
4.2.4 Preparation and Collection of FTIR Spectra 67
4.2.5 Partial Least-Squares Regression (PLSR) and Partial Least-Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) Modeling 67
4.2.6 Infrared Spectral Biomarkers 68
4.2.7 Statistical analysis 68
4.3 Results 72
4.3.1 PLSR using FTIR Spectra of Established Human Adipocytes 72
4.3.2 PLSR using FTIR Spectra of Human Adipocytes and Human Adipocyte-Conditioned Media on a Slide Glass 74
4.3.3 Comparing PLSRs 77
4.3.4 Infrared Spectral Biomarkers on Human Beige Adipocytes 77
4.3.5 Infrared Spectral Biomarkers on Human Beige Adipocyte-Conditioned Media on a Slide Glass 80
4.3.6 PLS-DA, Classification of Adipocytes and Expression Distribution of Adipogenesis Genes in Adipocytes 80
4.4 Discussion 83
CHAPTER V GENERAL SUMMARY AND CONCLUSIONS 90
REFERENCES 95
APPENDICES 111
A. Applied Sciences. 2022; 12(6):3071 112
B. Photonics. 2023; 10(1):2 123
