Molecular cloning and characterization of aflatoxin-degrading multicopper oxidase from Bacillus subtilis in Escherichia coli and its application for visual detection of aflatoxin
Bacillus subtilis 유래 aflatoxin-degrading multicopper oxidase의 유전자 클로닝 및 효소 특성화를 통한 아플라톡신 시각적 검출법 개발
- 주제(키워드) Aflatoxin , multicopper oxidase , endospore coat proteinA , Visual detection , ABTS
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 김영완
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 8
- 학위구분 석사
- 학과 대학원 규제과학과
- 세부전공 기능성식품 규제과학
- 원문페이지 66 p
- UCI I804:11009-000000277054
- DOI 10.23186/korea.000000277054.11009.0000131
- 본문언어 영어
초록/요약
Aflatoxin is one of the naturally occurring mycotoxins produced by Aspergillus flavus, A. paraiticus species. Due to the safety issues, simple and rapid detection methods for aflatoxins are requested to monitor the contamination of aflatoxins in foods at manufacturing sites. However, it is challenging to perform on-site aflatoxin analysis due to the requests of expensive analytical instruments and expert operators. This study aims to develop a rapid on-site visual detection of aflatoxin using multicopper oxidases (MCOs) which show laccase activity being capable of degrading aflatoxins. The genes for endospore coat protein A from Bacillus subtilis (BsCotA) and MCO from Lactobacillus sakei (LsMCO) were cloned and expressed in Escherichia coli. Both enzymes showed maximum laccase activity using 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) as a substrate at pH 4.0 and 60°C. As BsCotA possessed higher specific laccase activity than LsMCO, BsCotA was selected as the enzyme for the aflatoxin detection. Upon employing aflatoxin B1 (AFB1) as the substrate, BsCotA exhibited its maximum activity at pH 7.5 and 80°C. As reported in literature, the aflatoxin-degrading activity of BsCotA was also enhanced by the use of redox mediators. Whereas 27% of AFB1 degradation was observed after 3 h with no mediator, 83% of the AFB1 was degraded by BsCotA at the pH 7.5 and 80°C in the presence of syringaldehyde as the mediator. ABTS and acetosyringone exhibited better performance than syringaldehyde as the mediators, leading to almost 90% of AFB1 was degraded within 30 min, which translates to a 17-fold improvement. To develop a visual detection of aflatoxin, ABTS was selected as a dye indicator. The oxidized ABTS in an acidic pH by BsCotA was reduced by the reaction with AFB1 in the samples, resulting in the decrease of blue color intensity. Due to the facile oxidation of ABTS at acidic pH, the addition of NaOH solution (160 mM) not only inactivated BsCotA but also prevented the re-oxidation of the reduced ABTS after the reaction with AFB1. Upon employing AFB1 from 0 to 160 μM at intervals of 20 μM in presence of 100 μM ABTS as the dye indicator, the plot of the absorbance over AFB1 concentration showed two phases: one is the phase of rapid decline in the slope of absorbance until 60 μM AFB1, and the other is that with a gentle descent slope. More importantly, the color development was clearly recognized with naked eye in the phase in the presence of AFB1 lower than 60 μM. It was possible to detect ca. 15 μM of AFB1 in the sample in presence of 30 μM ABTS, which was the minimum concentration of AFB1 to confirm the color development visually. In conclusion, the visual detection method aflatoxin with BsCotA using a 2:1 ratio of ABTS and AFB1 allows knowing whether the concentration of AFB1 in the sample is higher than the half of the subjected ABTS as the regulation point. The visual detection method in this study shows a potential as on-site aflatoxin visual detection method without instrumental analysis.
more초록/요약
아플라톡신 (Aflatoxin)은 Aspergillus flavus, A. paraiticus 종에 의해 자연적으로 생산되는 곰팡이 독소 중 하나이다. 식품 안전 문제로 인하여 현장에서 생산되는 식품 내 아플라톡신의 오염을 모니터링하기 위해 아플라톡신에 대한 간단하고, 신속한 검출방법이 요구된다. 아플라톡신을 분석하기 위해서 고가의 분석장비 및 전문인력이 필요하기 때문에 현장에서 어려움을 겪는다. 본 연구는 라카제(laccase) 활성을 갖고, 아플라톡신을 분해하는 다중구리 산화효소 (multicopper oxidases, MCOs)를 이용하여 아플라톡신 신속검출 기술을 개발하고자 한다. Baciilus sibtilis에서 유래한 내포자 단백질A (endospore coat protein A) (BsCotA)와 Lactobacillus sakei (LsMCO)에서 유래한 MCO 유전자를 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)을 이용해서 복제한 후 Escherichia coli에서 발현했다. 두 효소의 라카제 활성은 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)를 기질로 사용하여 pH 4.0과 60℃에서 최대였다. BsCotA는 LsMCO보다 라카제 비활성이 높기 때문에 아플라톡신 검출효소로 선택되었다. Aflatoxin B1 (AFB1)을 기질로 사용했을 때 BsCotA는 pH 7.5와 80℃에서 최대활성을 나타내었다. 논문에서 보고된 바와 같이, BsCotA의 아플라톡신 분해활성 또한 산화환원 매개체를 이용했을 때 증가하였다. 매개체 없이 3시간 후 27%의 AFB1이 분해된 반면, 매개체로서 시린지알데하이드가 존재하는 pH 7.5, 80℃에서 BsCotA에 의해 83%의 AF1이 분해되었다. ABTS와 아세토시링곤은 매개체로서 시린지알데하이드보다 더 좋은 매개체로 작용하여 30분 이내에 약 90%의 AFB1을 분해했고, 이는 중재자가 없을 때 보다 약 17배 향상되었다. 아플라톡신의 시각적 검출을 개발하기 위해 ABTS를 dye indicator로 선택하였다. BsCotA에 의해 산성 pH에서 산화된 ABTS는 AFB1과 반응하여 환원되고 ABTS로 환원되어 파란색의 진하기가 감소하였다. 산성 pH에서 ABTS가 산화되기 때문에 NaOH 용액 (160 mM)의 첨가로 BsCotA를 불활성화 시켜 AFB1과 반응하여 환원된 ABTS의 재산화를 방지하였다. Dye indicator로 100 μM ABTS를 사용하고, AFB1을 0 ~ 160 μM의 AFB1을 사용했을 때, AFB1 농도에 대한 흡광도 그래프는 두가지 양상을 보였다. 하나는 60 μM AFB1까지 흡광도가 급격히 감소하였고, 다른 하나는 60 μM 이후 완만히 하강하는 기울기를 갖는 양상을 보였다. 결정적으로 60 μM보다 낮은 농도의 AFB1이 존재하는 단계에서 육안으로 발색을 구별할 수 있었다. 30 μM ABTS가 존재 할 때, 약 15 μM AFB1을 검출할 수 있었으며, 이는 시각적으로 발색을 확인하기 위한 최소 농도였다. 결론적으로 BsCotA를 사용한 아플라톡신의 시각적 검출방법은 ABTS와 AFB1의 비율을 2:1로 사용하면, 검체 내 AFB1의 농도가 규제 농도보다 높은지 여부를 파악할 수 있다. 본 연구의 시각적 검출방법은 분석장비가 없는 현장에서 아플라톡신을 시각적으로 검출 할 수 있는 방법으로서 가능성을 보여준다.
more목차
I. Introduction 1
1.1. Mycotoxin and aflatoxin 1
1.2. Aflatoxin in Food 4
1.3. Laccase and CotA as aflatoxin degradation of enzymes 5
1.4. Aims of this study 9
II. Materials and Methods 11
2.1. Bacterial strains and plasmids 11
2.2. Enzymes and Chemicals 11
2.3. Transformation of E. coli 13
2.4. PCR amplification of the genes for BsCotA and LsMCO 13
2.5. Construction of recombinant plasmids 14
2.6. Production and purification of recombinant BsCotA and LsMCO in E. coli 15
2.7. Determination of protein concentration 16
2.8. SDS-PAGE analysis 17
2.9. Characterization of BsCotA and LsMCO as laccases 18
2.10. Preparation of standard curve for AFB1 using HPLC 19
2.11. Effects of pH and temperature on AFB1 degradation by BsCotA 19
2.12. Effect of mediator on degradation of AFB1 with BsCotA 20
2.13. Visual detection of AFB1 20
III. Results and Discussion 22
3.1. Identification of multicopper oxidase homologues 22
3.2. Cloning of genes for MCOs 25
3.2.1. Cloning of LsMCO from L. sakei in E. coli 25
3.2.2. Cloning of BsCotA from B. subtilis 25
3.3. Production and purification of BsCotA and LsMCO in E. coli 28
3.4 Laccase property and characterization of recombinant MCO 31
3.5. Aflatoxin B1 degradation properties of recombinant MCO 37
3.6. Effect of mediator on degradation of AFB1 with BsCotA 41
3.7. Visual detection of AFB1 with ABTS 41
IV. Conclusion 47
V. References 49
