Roles of the Embryonic Stem Cell Protein L1TD1 on RNA Condensates
RNA 응집체에 대한 배아줄기세포 단백질 L1TD1의 역할
- 주제(키워드) Human embryonic stem cell , L1TD1 , LINE1 , G3BP2 , RNA condensate , Stress granule , Aberrant granule , Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , TDP-43 , FUS , Autophagy , Glutamic-acid rich domain
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 송호석
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 8
- 학위구분 석사
- 학과 대학원 의과학과
- 세부전공 의생명과학 전공
- 원문페이지 107 p
- UCI I804:11009-000000276928
- DOI 10.23186/korea.000000276928.11009.0000128
- 본문언어 영어
초록/요약
LINE-1 type Transposase Domain-containing 1 (L1td1), which encodes a cytoplasmic RNA-binding protein (RBP), has been identified as one of the embryonic stem cell-associated transcripts (ECATs). Despite the specific induction by transcriptional pluripotency factors, L1td1 is dispensable for pluripotency and self-renewal in mouse cells. Unlike its mouse paralogue, human L1TD1 is essential for the self-renewal of human embryonic stem cells (hESCs). However, its role in hESCs and how its function relates to that of its ancestral protein, the first open reading frame of L1 (L1 ORF1p), is still unclear. Here, we identified target RNAs of L1TD1 using a cross-linking immunoprecipitation (CLIP) method. Besides a cohort of mRNAs which include repetitive mRNAs of the KRAB-ZNF family, L1TD1 bounds positive strands of L1 elements suggesting a functional legacy of L1 ORF1p. The targets of L1TD1 were enriched in unexplored stress granule-like ribonucleoprotein (RNP) condensates in hESCs. In addition, L1TD1 enhanced the translation of a population of mRNAs which were also enriched in the condensate. These observations lead us to the hypothesis that L1TD1 is a translational regulator that retrieves mRNAs from translationally inert partitions. In accordance with this model, ectopically expressed L1TD1 in HeLa cells facilitated the dissolution of stress granules and pathological granules of mutant TDP-43 or FUS proteins which are implicated in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). The ORF1-homology domain and the glutamate-rich domain induced autophagy and dispersal of RNP, respectively. In addition to suggesting the role of L1TD1 as a translational pluripotency factor, we propose a novel therapeutic strategy for the treatment of neurodegenerative diseases.
more초록/요약
세포 내 RNA 결합 단백질 (RBP)을 발현하는 LINE-1 type Transposase Domain-containing 1 (L1td1)은 배아줄기세포 전사체 (ECATs)의 하나로 확인되었었다. 전사적인 전분화능 인자들에 의한 특이적인 유도에도 불구하고, L1TD1은 마우스 세포에서 전분화능과 자가생산에 대하여 의존적이지 않다. 마우스 파라로그 (paralogue)와 달리, 인간 L1TD1은 인간배아줄기세포 (hESCs)의 자가생산에 필수이다. 그러나, hESCs에서 L1TD1의 역할과 그 기능이 어떻게 L1TD1의 조상 단백질 L1의 첫 번째 열린 개방 해독 틀 (L1 ORF1p)과 관련한지는 여전히 불명확하다. 여기서, 우리는 가교-결합 면역침강법 (CLIP)을 사용하여 L1TD1의 표적 RNA들을 확인하였다. KRAB-ZNF 계열의 반복 mRNA를 포함한 다른 mRNA 표적들 이외도, L1TD1은 L1 ORF1p의 기능적인 유산을 제시하는 L1 요소의 양성 가닥에 결합하였다. L1TD1의 표적들은 hESCs에서 탐구되지 않은 스트레스 과립 같은 리보핵단백질 (RNP) 응집체에 풍부하였다. 추가적으로, L1TD1은 이 응집체에 풍부한 mRNA들의 번역을 강화시켰다. 이러한 관측들은 L1TD1이 번역적으로 활성이 없는 구역으로부터 mRNA들을 회수한다는 변역적인 조절자라는 가설을 이끈다. 이 모델과 일치하여, HeLa 세포주에서 이소성으로 발현된 L1TD1은 생리학적 과립과 근위축성측색경화증 (ALS) 및 전두측두엽치매 (FTD)의 원인인 TDP-43 또는 FUS 단백질들의 병리학적 과립의 해소를 가능하게 하였다. ORF1-상동성 영역과 글루탐산-풍부 영역은 각각 자가포식과 RNP의 해소를 유도하였다. 전사적인 전분화능 인자로서 L1TD1의 역할을 제시하는 것 이외도, 우리는 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 새로운 치료적 전략을 제안한다.
more목차
TABLE OF CONTENTS
ABSTRACT---i
국문 초록 (KOREAN ABSTRACT)---ii
PREFACE---iv
ACKNOWLEDGEMENTS---v
TABLE OF CONTENTS---vi
LIST OF TABLES---ix
LIST OF FIGURES---x
1. INTRODUCTION---1
1.1 Embryonic stem cell---1
1.2 Post-transcriptional regulation---3
1.3 LINE1 type transposase domain-containing 1 (L1TD1)---5
1.4 Cross-linking immunoprecipitation (CLIP)---7
1.5 Long Interspersed Nuclear Element 1 (LINE1)---9
1.6 Krüppel-associated box domain zinc finger (KRAB-ZNF)---11
1.7 Inflammatory signaling pathways---13
1.8 mTOR signaling pathway---15
1.9 Stress granule (SG)---17
1.10 The Ubiquitin-Proteasome System (UPS) and Autophagy---19
1.11 Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)---21
1.12 Overview---23
2. RESULTS---24
2.1 The stem cell-specific protein L1TD1 is an RNA-binding protein that binds to transposable elements and various RNAs---24
2.2 L1TD1 affects translation of a cohort of mRNAs through post-transcriptional regulation---28
2.3 L1TD1 regulates translation through partitioning of target mRNAs into RNA condensates---33
2.4 RNA-binding proteins L1TD1 and G3BP2 share a target mRNA in the RNA condensates, and G3BP2 is independent in maintaining these partitions---37
2.5 The RNA-binding protein L1TD1 is a component of Stress granules and P-bodies---40
2.6 L1TD1 facilitates the dissolution of the formation of physiological stress granules in HeLa cells---43
2.7 L1TD1 performs dissolution of the formation of aberrant granules that cause neurodegenerative diseases---46
2.8 Stress granule formation exerts post-translational regulation on L1TD1 levels and L1TD1 colocalizes with autophagy involved in the dissolution of stress granules---49
2.9 Additional domains of L1TD1 affect the dynamics of stress granules and aberrant granules---52
3. DISCUSSION---57
4. EXPERIMENTAL PROCEDURES---60
4.1 Cell culture and transfection (H1)---60
4.2 Retrotransposition assay---61
4.3 CLIP---62
4.4 Sequencing library construction---63
4.5 Mapping of CLIP-seq reads---64
4.6 Ribosome immunoprecipitation---65
4.7 Fractionation---66
4.8 Cell culture and transfection (HeLa, HEK293T, NIH3T3, CHO-K1)---67
4.9 Generation of HeLa-eIF3B-eGFP cell line---68
4.10 Plasmids and transfection---69
4.11 Stress granules induction and recovery---70
4.12 Immunofluorescence---71
4.13 Stress granules quantification---72
4.14 Western blotting---73
4.15 RT-PCR---74
4.16 Puromycin incorporation assay---75
4.17 Suppression of autophagy and proteasome---76
4.18 RNase treatment---77
4.19 Antibodies---78
4.20 Statistical analysis---79
5. REFERENCES---80
