Study on the mechanism of hyperactivation of EGFR signaling by autophagy-mediated EGF secretion in NANOG+ immune-refractory tumor cells
- 주제(키워드) Immunotherapy , Autophagy , NANOG , MAP1LC3B , HK2
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 김태우
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 대학원 의과학과
- 세부전공 의생명과학 전공
- 세부분야 해당없음
- 원문페이지 107 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000270578
- UCI I804:11009-000000270578
- DOI 10.23186/korea.000000270578.11009.0001409
- 본문언어 영어
초록/요약
During T cell-based immunotherapy, immune pressure drives tumor cells to acquire immune-refractory phenotypes. Cytotoxic T lymphocyte (CTL)-mediated immune selection endows NANOG+ tumor cells with multi-aggressive phenotypes such as stem-like and immune-refractory properties that make them resistant to CTL-mediated killing. Although it has been confirmed that AKT signaling is important in NANOG-mediated multi-aggressiveness, its molecular mechanism has not been elucidated. Therefore, further mechanistic studies are required to overcome the NANOG-mediated multi-aggressiveness. Autophagy is a well-known mechanism for the degradation of cytosolic components under cellular stress conditions, such as a nutrient deficiency. Recently, it has been reported that autophagy-related proteins can also affect unconventional protein secretion known as a secretory autophagy. Here, I found that NANOG promoted the transcription of MAP1LC3B (LC3B) and hexokinase-2 (HK2). Induction of LC3B, increased the number of LC3B+ autophagosomes and epidermal growth factor (EGF) secretion. Subsequent activation of the EGFR/AKT axis rendered NANOG+ cancer cells resistant to CTL-mediated apoptosis. Similarly, I also revealed that HK2, another transcriptional target of NANOG, could promote autophagy-dependent secretion of EGF. Building upon idea that HK2 functions as a molecular switch from glycolysis to autophagy to maintain cellular energy homeostasis, I show that HK2 signaling also serves as a critical nexus of energy homeostasis and survival mediated by secretory autophagy through the interaction of HK2 with mTORC1 via its TOS motif. Importantly, the inhibition of HK2-mTORC1 interaction by 2-deoxy-d-glucose (2-DG) treatment in the refractory tumor cells abrogated the secretion of EGF and subsequently, rendered the tumors susceptible to PD-1 blockade. Thus, these findings demonstrate a novel link among immune-resistance, stem-like phenotypes, and LC3B-mediated secretory autophagy in immune-refractory tumor cells. At the same time, the findings imply that autophagy-dependent EGF secretion can function as the main molecular target for controlling NANOG+ immune-refractory cancer.
more초록/요약
T 세포 이식 및 면역관문억제제와 같은 항암면역치료 방법은 우수한 효과를 보이나, 여전히 대다수에서 불응성이 발견되고 있다. 이를 극복하기 위하여, 항암면역치료에 대한 불응성의 핵심 원인 기전을 이해하고 표적가능한 인자를 규명하여 치료 효율을 증진시킬 전략 개발이 시급한 실정이다. 선행연구에서 선별한 불응성 핵심원인인자 NANOG는 전사인자로써 다양한 면역내성 하위인자의 발현을 복합적으로 유도하여 핵심 경로로AKT 신호를 활성화시킴을 확인하였으나, AKT 활성의 분자적 기전에 대해 명확히 규명되지 않았다. 항암면역치료 불응성을 극복하기 위하여 T 세포 이식 치료 및 면역관문억제제 치료에 대한 내성암 모델을 확립하였고, NANOG+ 종양세포가 치료과정 중 발생하는 면역선택압에 의해 선별되어 재증식함을 확인하였다. 흥미롭게도 이러한 면역불응성 암세포는 NANOG에 의한 MAP1LC3B (LC3B)의 전사촉진으로 인해 LC3B+ 자가소포체가 증가되어 있었으며, LC3B가 EGF의 분비 증가 및 EGFR-AKT 신호경로의 활성화를 유발하는 중요한 인자임을 확인하였다. 이 현상은 면역관문억제제 내성암 모델에서도 재현되었지만, 현재 NANOG를 직접적으로 표적화할 수 있는 임상적 저해제는 개발된 바 없다. 따라서 NANOG 매개 면역관문억제제 불응성 획득의 명확한 분자 기전을 규명을 통한 임상 적용 가능한 핵심표적인자 선별과 그 기전 이해가 필수적이라고 판단된다. 이에 따라 NANOG 매개 다중악성 현상에서 핵심인자이자 저해제가 개발된 인자를 선별하고자 하였다. 다양한 대사관련 인자들의 발현은 암의 진행 및 항암제 내성 등 암의 다양한 악성현상과 연관되어 있음이 보고되었고 대사관련 인자들 중에서 특히 Hexokinase 2 (HK2) 만이 면역관문억제제 불응암 시그니처와 양적 상관관계가 있음을 발견하였다. 기전적으로 HK2는 mTORC1과 결합함으로써 mTORC1의 기능을 억제하고 자가소포체 형성에 중요한 ULK1의 활성을 유도함으로써 자가포식을 유도할 수 있었으며, 이는 면역불응성암의 자가포식 매개 EGF의 분비를 증진시킬 수 있었다. HK2는 NANOG의 전사타겟으로 특히 간암에서 상호 발현의 양적 상관관계가 있었고, 이들 발현이 높은 환자들은 암줄기세포 및 세포사멸 내성등의 표현형과 연관되어 있었다. HK2 저해제인 2-DG를 처리하였을 때, 실험관 내에서 NANOG 매개 불응성 표현형이 저해될 뿐아니라, 생체 내에서 PD-1 항체에 대한 불응성을 극복할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구는 면역치료 불응성을 극복할 수 있는 주요 기전으로 NANOG-LC3B 분자축의 상관관계를 입증했을 뿐 아니라, 이를 표적할 수 있는 임상적용가능한 제재로 HK2 저해제를 제시하였다. 이러한 발견들은 NANOG 발현이 높은 난치적 암을 극복할 수 있는 치료 전략의 논리적 근거를 제공하는 것으로 함암 면역치료 발전에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
more목차
Table of contents
Abstract………………………………………………………………………... I
Abstract in Korean ………………………………………………………..III
Table of contents………………………….………………………………… VⅠ
List of figures and tables………………………………………………IX
List of abbreviations………………………………………………………XII
Backgrounds…………………………………………………………………... 1
1. Challenges and limitations in cancer immunotherapy………...……... 1
2. NANOG-mediated multi-aggressive phenotypes of tumor cells ……. 4
3. The role of autophagy in cancer…………...………………...……...... 6
4. Hexokinase 2 as a molecular switch from glycolysis to autophagy.... 9
Chapter I NANOG-induced LC3B upregulation promotes immune resistance and stem-like properties of immune-refractory tumor cells by hyperactivating EGFR signaling……………………………………………………………11
1. Introduction ………………………………………………………………12
2. Materials and Methods ………………………………………………....15
3. Results ………………………………………………………………...27
3.1 Immune-refractory tumor cells accumulate aberrant autophagosomes under starvation ………………………………………………………………... 27
3.2 ATG7 knockdown reverses immune resistant and CSC-like phenotypes of immune-refractory tumor cells…………………………………………...29
3.3 NANOG regulates abundance of autophagosomes in tumor cells…...31
3.4 LC3B expression is directly regulated by NANOG….….….….…34
3.5 LC3B is required for NANOG-dependent aggressive phenotypes through AKT signaling pathway…………………………………………………….37
3.6 LC3B contributes to EGF secretion resulting in activation of EGFR signaling…………………………………………………………………….39
3.7 LC3B promotes EGF secretion by secretory autophagy mediated pathway…………………………………………………………………41
3.8 NANOG-LC3B-p-EGFR axis correlates with tumor progression and disease outcome in human cervical neoplasia ……………………45
3.9 Inhibition of LC3B sensitizes NANOG+ immune-refractory tumor to ACT therapy………………………………………………………………….50
4. Discussion ………………………………………………………………….52
Chapter II HK2 renders the resistance to anti-PD-1 therapy in immune-refractory tumor cells through autophagy-mediated hyperactivation of EGFR signaling ……………………………………………………………….56
1. Introduction ………………………………………………………………57
2. Materials and Methods …………………………………………………....60
3. Results …………………………………………………………………...67
3.1 Hyperactivated EGFR signaling is associated with non-response to ICB in HCCs………………………………………………………………………67
3.2 Activation of EGFR signaling is mediated by autophagy-dependent EGF secretion in immune-refractory tumor cells………………………………….71
3.3 HK2 expression is associated with immune-refractory non-responder phenotype to ICB therapy…………………………….73
3.4 Silencing of HK2 expression reverses immune-resistance and CSC-like phenotypes through abrogating the EGF-p-EGFR-AKT axis……………….75
3.5 Expression of HK2 is predisposed to autophagy induction by inhibiting of mTORC1 activity through the direct binding of HK2 with mTORC1……….77
3.6 The NANOG-HK2 axis is associated with refractoriness to ICB therapy in human HCC……………………………………………………………….81
3.7 HK2 is an appropriate molecular target for controlling immune-refractory NANOGhigh tumor cells. …………………………………………………….84
3.8 Combination therapy with 2-DG and anti-PD-1 has a synergistic antitumor effect…………………………………………………………………….86
4. Discussion ……………………………………………………………….88
References……………………………………………………………….….…..92
