Whole-Genome Sequence-based Classification of Lactic Acid Bacteria
- 주제(키워드) Whole Genome sequencing , Lactic Acid Bacteria , NGS
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 이하나
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위구분 석사
- 학과 대학원 의생명융합과학과
- 원문페이지 78 p
- UCI I804:11009-000000257581
- DOI 10.23186/korea.000000257581.11009.0001241
- 본문언어 영어
초록/요약
Lactic acid bacteria (LAB)는 젖산을 생성하여 식품 발효와 장내 건강에 중요한 미생물로 알려져 있고, 최근에는 신약 개발에까지 사용되는 미생물을 총칭한다. 그러나 LAB 내 유전적 차이가 매우 작아 기존의 분류법 만으로는 정확한 분류가 어렵다. 이를 해결하기 위해 전장유전체를 이용한 연구가 반드시 필요하다. 본 연구에서는 LAB의 대표적인 두 종을 대상으로 전장유전체 시퀀싱 및 비교유전체 분석을 수행하였다. Bifidobacterium longum 은 산업적으로 가장 많이 이용되는 균주 중 하나이다. 종 내 균주 다양성을 확인하기 위해서 46개의 16S rRNA와 28개의 purF유전자를 이용하여 phylogenetic tree를 그렸으나 homology가 높아 명확한 구분을 할 수가 없었다. 이를 해결하기 위하여 전장유전체 정보가 없는 26개 strain을 수집하여 NGS로 분석하였다. Genomic DNA를 추출하여 PacBio RSII system로 시퀀싱 하고 SMAR Portal 로 assemble 하였다. 26개 Bifidobacterium strain을 sequencing한 결과 JCM 7007을 제외한 strain 모두에서 플라스미드가 없는 circular complete genome를 assemble하였다. 이들은 평균 288.93x의 coverage와 2,556,132 bp의 평균 length를 가졌다. 확보한 유전체를 바탕으로 B. longum 종의 전장유전체 계통수를 그리고 종 내 다양성을 확인할 수 있었다. 산업적으로 가장 많이 이용되는 다른 종으로 Lactiplantibacillus plantarum 이 있다. 이 종 내의 균주 다양성을 유전체 수준에서 확인하기 위하여 기존에 공개된 53개 균주의 complete genome을 대상으로 comparative genome 분석을 수행하였다. 이를 위해 single copy core gene 기반의 유전체 계통수를 그리고 그룹간 차이를 당 이용성, short chain fatty acid(SCFA)의 생합성, vitamin과 NRPS/PKS의 생합성 여부로 비교하였다. 1,916개의 single copy core gene을 이용하여 유전체 계통수를 확인한 결과 종 내에서 균주의 다양성이 크게 2개의 group으로 나뉘었다. 이는 기존에 알려진 것과 달리 분리원이나 지역에 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 그 결과 모든 strain이 sucrose, maltose, isomaltose, cellobiose와 lactose를 이용하지만 trehalose는 모두 이용하지 못하여 그룹 간 차이가 없었다. Vitamin과 SCFA 생성 여부 역시 그룹간 차이는 없었다. 그러나 group 1에서만 NRPS의 생합성에 관여할 것으로 여겨지는 SH83_02515, SH83_02530와 orthologous genes들이 확인되었다. Classical 한 분류 방법으로는 gene의 pathway나 subsystem을 확인하는데 한계가 있었다. 본 연구에서는 whole genome을 이용하여 분자 유전학적인 분석을 더해 신종 균인 Massilia. LPB0304T를 동정하였다. 본 연구결과 26개 Bifidobacterium strain의 whole genome을 추가 분석을 위한 토대로 확보하는데 성공하였고, L. plantarum의 comparative genome 분석을 통해 NRPS의 생합성에서의 차이가 group이 나눠지는데 중요한 원인이 될 수 있다는 사실을 유추할 수 있었다. 또한 기존의 분류학적 방법과 더불어 whole genome을 이용한 분석을 수행하여 새로운 신종을 동정했다.
more목차
ABSTRACT I
TABLE OF CONTENTS III
LIST OF FIGURES V
LIST OF TABLES VII
Ⅰ. INTRODUCTION 1
1. LACTIC ACID BACTERIA 1
1.1. Useful LAB for human 1
1.2. Taxonomy of LAB 2
1.3 Whole genome sequence of LAB 3
2. COMPARATIVE GENOMICS 4
2.1 Comparative genomics 4
2.2 Phylogenomics of LAB 5
3. IDENTIFICATION OF BACTERIA 6
3.1. Classical bacterial identification 7
3.2. Importance of whole genome analysis in LAB identification 8
4. OBJECTIVES OF THIS STUDY 9
Ⅱ. MATERIALS & METHODS 10
1. GENOME SEQUENCING OF BIFIDOBACTERIUM LONGUM 10
1.1 Strain collection 10
1.2 Genomic DNA extraction 14
1.3 Whole genome sequencing and assembly 16
2. COMPARATIVE GENOME ANALYSIS OF LACTIPLANTIBACILLUS PLANTARUM 17
2.1. Strain collection 17
2.2 Gene prediction and orthologous gene clustering 20
2.3 Construction of phylogenomic tree 20
2.4 Functional annotation of gene families 21
3. ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF NOVEL BACTERIAL STRAIN 22
3.1 16S rRNA gene PCR amplification and sequencing 22
3.2 Phylogenetic analyses 24
3.3 Phenotypic and physiological characterization 24
3.4 Whole-genome sequence analysis 28
Ⅲ. RESULTS 29
1. STRAINS OF BIFIDOBACTERIUM LONGUM SUBSPECIES 29
1.1 Evaluation of genomic DNA quantity and quality 29
1.2 General features of sequenced genomes 31
2. STRAINS OF LACTIPLANTIBACILLUS PLANTARUM 34
2.1 Pan-genome analysis 34
2.2 Phylogenetic trees 36
2.3 Functional annotation 38
3. IDENTIFICATION OF MASSILIA SPECIES 43
3.1. Phylogenetic characteristics 43
3.2. Phenotypic characteristics 46
3.3. Genomic characteristics 52
Ⅳ. DISCUSSION 57
Ⅴ. REFERENCES 59
국문 초록 65
