Anti-inflammatory immune responses mediated by Pseudomonas aeruginosa-derived ExoY and DnaK
- 주제(키워드) Anti-inflammation
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 하운환
- 발행년도 2020
- 학위수여년월 2020. 2
- 학위구분 박사
- 학과 대학원 생명정보공학과
- 원문페이지 118 p
- UCI I804:11009-000000126812
- DOI 10.23186/korea.000000126812.11009.0000953
- 본문언어 영어
초록/요약
Pseudomonas aeruginosa (녹농균, P. aeruginosa)는 감염시에 여러가지 독성 물질 을 분비하는데 이러한 물질들을 숙주로 수송하는 분비 시스템 중 type three 분 비 시스템이 잘 발달하였고, T3SS effector들은 숙주의 면역 반응조절에 필수적으 로 필요하다고 알려져 있다. Effector들 중 하나인 ExoY (exozyme Y)는 다른 effector들과 달리 염증 반응과 관련된 연구가 적다. 염증반응에 중요한 인터루 킨-1 베타 (Interleukin-1b IL-1b)의 생성과 pyroptotic 세포 사멸로 대표되는 염증 조절복합체 (Inflammasome) 활성에 exoY가 미치는 영향에 대해 알려진 것이 거 의 없다. 이 연구를 통해 exoY 유전자가 없는 균주보다 exoY 유전자를 가지고 있는 균주에서의 il-1b의 전사가 적게 일어남을 확인하였다. 또한 IL-1b 생성과 pyroptotic 세포 사멸 역시 exoY gene을 가진 균주에서 감소하는 경향을 확인하 였다. 이러한 염증조절복합체 반응의 조절은 NF-B 신호 기전과 caspase-1의 활 성을 ExoY의 adenylate cyclase 효과에 의해 보다 늦게 일어난다. 또한 ExoY는 박테리아의 운동성을 저해하여 박테리아가 세포에 부착되는 정도를 줄여 ExoY 에 의한 저해 반응을 일으키는데 부분적 역할을 한다. 이러한 결과를 통해 종 합적으로 adenylate cyclase 활성을 가지고 있는 녹농균의 ExoY가 자신의 운동성 을 저해하고 숙주의 염증반응 과정을 늦추어 염증조절복합체 관련 반응을 감소 시킨다는 것을 확인하였다. 인터루킨-27 (Interleukin-27, IL-27)은 인터루킨-12 유사 사이토카인 중 하나로, 염증반응을 제한하는 사이토카인으로 잘 알려져 있으며, p28 서브 유닛과 Epstein-Barr virus induced gene 3 (EBI3)로 구성되어 있다. 항 염증성 사이토카인 인 IL-27은 폐혈증이 생긴 쥐에서 이차적인 병원유래의 녹농균 감염에 의하 여 증가됨으로써 감염에 대한 민감성을 높이고 병원균의 제거를 감소시킨다. 하지만 녹농균 유래의 분자에 의한 IL-27 생성에 대한 연구는 이루어지지 않 고 있다. 이 연구를 통해 녹농균 유래의 heat shock protein 70과 유사한 DnaK 가 ebi3 발현을 증가시킴으로써 IL-27의 생성을 유도한다는 것을 설명하고자 한다. 하지만 ebi3를 서브 유닛으로 공유하는 인터루킨-35 (Interleukin-35, IL-35) 를 증가는 시키지 못하였다. 생성된 IL-27은 IL-10의 생성을 유도하는 생물학 적 활성을 가지고 있다. DnaK에 의한 ebi3 발현은 NF-kB 와 AKT 신호에 의 해 유도되며 TLR2가 아닌 TLR4에 의해 일어난다. 흥미롭게도 AKT가 아닌 NF-B는 TLR4와 연관되어 있다. 종합적으로 이 연구를 통해 녹농균 유래의 DnaK는 TLR4 의존적인 NF-B 신호기전과 TLR4 비 의존적인 신호기전에 의해 ebi3 발현이 증가되고 항 염증성 사이토카인 IL-27을 생성하는 것을 확 인하였다.
more목차
I. ExoY 11
1. Introduction 12
1. Pseudomonas aeruginosa 12
2. Secretion system of Pseudomonas aeruginosa 13
3. Type 3 secretion system 17
4. T3SS effector proteins 22
5. Interleukin-1 24
6. Pyroptosis 26
2. Material and Method 28
1. Reagents and Solutions 28
2. Bacterial strains and culture conditions 29
3. Mammalian cell type and culture conditions 30
4. Plasmids and transfections 31
5. qRT-PCR analysis 32
6. Cytotoxicity assay and IL-1 ELISA 33
7. Immunoblot analysis 34
8. Swimming motility assay 35
9. Bacterial adhesion assay 36
10. Statisical analysis 37
3. Results 38
1. exoY deficiency increases the expression of pro-inflammatory cytokines 38
2. ExoY is sufficient to decrease the expression of Il-1 40
3. The adenylate cyclase activity of ExoY is involved in the reduction of both IL-1 production and cytotoxicity 43
4. The ExoY-mediated reduction in cytotoxicity is through suppression of bacterial motility and delayed activation of both NF-B and caspase-1 49
4. Discussion 57
II. DnaK 62
1. Introduction 63
1. Interleukin-27 63
2. Heat Shock proteins 65
3. Hsp70-like protein;DnaK 66
2. Material and Method 69
1. Reagents and Solutions 69
2. Bacterial strains and culture conditions 70
3. Mammalian cell type and culture conditions 71
4. Construction of His-tagged DnaK plasmid and the purification of recombinant protein 72
5. Quantitative real-time PCR 73
6. Immunoblot analysis 74
7. Enzyme-linked immunosorbent assay 75
8. siRNA transfection 76
9. Statistical analysis 77
3. Results 78
1. P. aeruginosa-mediated induction of ebi3 expression 78
2. P. aeruginosa-derived DnaK induces the expression of ebi3 81
3. DnaK-induced EBI3 is involved in the formation of IL-27 but not IL-35 85
4. DnaK-promoted formation of IL-27 is biologically active in increasing the expression of il-10 87
5. DnaK-induced expression of ebi3 is under the control of Akt/NF-kB signaling pathways 89
6. DnaK-mediated induction of ebi3 expression under the control of TLR4 but not TLR2 93
4. Discussion 97
Reference 102
감사의 글 113
