검색 상세

지역사회 획득 고병독성 Klebsiella pneumoniae 균주의 유전체학적 및 미생물학적 특성 연구

Genomic and microbiologic characteristics of community-acquired hypervirulent Klebsiella pneumoniae clinical isolates

  • 김종훈 (대학원 의학과 내과학전공)

초록/요약

배경: 본 연구논문의 연구배경으로, 오래전부터 중국, 대만, 한국 등에서 특별히 기저질환이 없는 건강한 사람들에서 고병독성 (hypervirulent) Klebsiella pneumoniae 에 의한 원발성 간농양의 발생과 혈류를 따라 전이성 감염을 유발함이 지속적으로 보고되고 있으나 장내 균속인 K. pneumoniae 가 원발성 간농양을 일으키는 병인기전은 많은 노력에도 불구하고 아직까지 정확히 규명되지 못하였다. 특히, 중국에서 hypervirulent K. pneumoniae 의 virulent plasmid가 carbapenem-resistant K. pneumoniae로 전달되면서 hypervirulent, carbapenem-resistant K. pneumoniae 가 출현하였으며 높은 사망률을 보임으로써 관련 연구의 중요성이 강조되고 있다. 본 연구논문은 원발성 간농양 환자들에서 분리되는 고병독성 K. pneumoniae 장집락 분리주들의 미생물학적 및 유전체적 분석을 실시하여 평가 하였다. 방법: 2017 과 2019년 사이 대한민국에 있는 일개 3차 상급 병원에서 같은 고병원성 폐렴간균 간농양 환자의 간과 대변에서 분리된 폐렴간균의 특성을 평가 하였다. 같은 고병원성 폐렴간균 간농양 환자의 간과 대변에서 분리된 폐렴간균 들과 공공 영역에서 이용 가능한 폐렴간균들의 병원성 인자들을 총유전체 분석 포함한 비교 유전체 분석으로 평가 하였다. 같은 고병원성 폐렴간균 간농양 환자의 간과 대변에서 분리된 폐렴간균 들의 병원성은 마우스 경구 접종 모델로 평가 하였다. 결과: 고병원성 폐렴간균 간농양 환자 36명중 11명이 대변 검체에서 폐렴간균이 검출되어 분석에 등록되었다. 환자 연령의 중간값은 71세 였고 대부분의 환자들은 (72.7%) 주요 기저 질환들을 가지고 있지 않았다. 간농양에서 얻어진 고병원성 폐렴간균들중, 가장 흔한 혈청형은 K1 (72.7%) 였고 다음으로는 K2 (27.3%) 이었다. 대변에서 얻어진 폐렴간균들중, 대부분은 K1/K2 혈청형이 아니 었다 (72.7%). K1/K2 혈청형이 아닌 것들에서는 시퀀스 타입 (ST) 의 여러 가변성과 (ST15, ST307, ST37, ST273, ST2622, ST42) 높은 확대 스펙트럼 베타 락타마제 존재율 (100.0%) 을 보였다. 원발성 고병원성 폐렴간균 간농양 환자에서 간과 대변 검체에서 얻어진 폐렴간균의 일치율은 낮았다 (27.3%). 같은 고병원성 폐렴간균 간농양 환자의 간에서 얻어진 폐렴간균 (KUH-L1) 과 대변 검체에서 얻어진 폐렴간균 (KUH-F1) 사이에서 주요한 병원성 인자들의 분포의 차이는 크지 않았다. 그러나, 대사 경로의 단백질 코딩 유전자들에 있어서는 차이점이 발견 되었다: KUH-F1 에서 Pullulanase secretion protein PulS, 그리고 KUH-L1 와 다른 간농양의 고병원성 폐렴간균들에서 Protein-N(pi)-phosphohistidine-D-fructose phosphotransferase 와 Protein-N(pi)-phosphohistidine-L-ascorbate phosphotransferase 이 보였다. 여러가지 용량으로 KUH-F1 을 경구 접종 시킨 마우스에서 분리한 6개의 간에서 (28.6%) 폐렴간균의 배양이 확인 되었다. 그러나, KUH-L1 와 KUH-F3 (K2/ST307) 을 경구 접종한 마우스에서 분리한 간에서는 폐렴간균의 배양이 확인 되지 않았다. 결론: 본 연구논문은 원발성 간농양 환자들에서 분리되는 고병독성 K. pneumoniae 장집락 분리주들의 미생물학적 및 유전체적 분석을 실시하여 아래와 같은 결과를 도출하였다. 첫번째, 고병독성 K. pneumoniae에 의한 원발성 간농양 환자들에서 약제 감수성 hypervirulent K. pneumoniae 뿐만 아니라 약제내성을 보이는 ESBL 생성 non-hypervirulent K. pneumoniae 에 의한 장 집락화를 확인하였으며, 따라서, 서로 공존의 집락화 상태에서 내성 형질 transmission이 이뤄지는 경우 ESBL 생성 hypervirulent K. pneumoniae 의 출현 잠재성을 제시하였다. 두번째, 한명의 환자로부터 분리된 hypervirulent K. peumoniae 간농양 분리주와 hyperviruent K. pneumoniae 장 집락 분리주의 next generation sequencing을 이용한 유전체를 비교분석하였을 때, 두 분리균주 사이에서 major virulence factors 분포 차이는 없었으나, metabolic pathway에 관련하는 type II secretory system을 통하여 세포 밖으로 분비되는 효소로 알려져 있는 Pullulanase enzyme PulS의 protein-coding sequence (CDS)가 hypervirulent K. pneumoniae 장집락 분리주에서만 유일하게 존재함을 발견하였으며, 이를 기반으로 장내 집락화된 hypervirulent K. pneumoniae 균은 PulS를 이용하여 immune evasion effects 와 survival benefit 을 초래하고, 장벽을 통과하여 혈류를 통하여 간으로 침투할 수 있으며, PulS가 invasion 관련된 병독인자의 하나로 작용할 수 있다는 가설을 제시하였다. 또한, hypervirulent K. pneumoniae 간농양 분리주에서만 protein-N(pi)-phosphohistidine-D-fructose phosphotransferase 와 protein-N(pi)-phosphohistidine-L-ascorbate phosphotransferase의 CDS가 존재함을 발견하였으며, hypervirulent K. pneumoniae 간농양 분리주의 경우 이를 이용하여 호기성 및 혐기성 환경에서 carbohydrate와 L-ascorbate 을 영양원으로 효과적으로 잘 이용하여, 균 성장과 간농양 형성을 촉진시킬 수 있다는 가설을 제시하였다. 세번째, 마우스 감염모델 실험을 통하여 상기한 hypervirulent K. pneumoniae 간농양 분리주와 장집락 분리주의 병인성 (pathogenicity) 확인하였을 때, hypervirulent K. pneumoniae 간농양 분리주를 접종한 마우스의 간조직으로부터 K, pneumoniae 가 분리되지 않았으나, hypervirulent K. pneumoniae 장집락 분리주의 경우 접종한 마우스의 간조직으로부터 K. pneumoniae 가 분리됨으로써 hypervirulent K. pneumoniae 장분리균주가 장벽을 넘어 간농양 감염을 야기할 수 있는 병인성을 가지고 있음을 증명할 수 있었다. 한편, hypervirulent K. pneumoniae 간 침투 병원성을 보이지 못하였는데, 이에 대하여는 특별히 간농양 분리주에서만 발견되었던 Anti-sigma-E factor RseA 의 CDS 존재로 인하여 균주 성장과 생존을 저하가 유발됨으로써 마우스 간조직내에서 K. pneumoniae 성장 저하를 유발할 수 있음을 제시할 수 있었으며, Anti-sigma-E factor RseA는 hypervirulent K. pneumoniae 의 differential growth 의 관련 인자로서의 가설을 도출할 수 있었다. 위에 기술한 바와 같이 본 연구논문은 비교유전체분석과 마우스 감염모델의 병인성 실험을 통하여 hypervirulent K. pneumoniae 장집락 분리균주의 간농양 유발과 연관될 수 있는 단백질들을 발견하였고, 이를 기반으로 타당하게 간농양의 병인성 가설을 제시하였다.

more

초록/요약

Background: Hypervirulent Klebsiella pneumoniae (hvKP) has been the significant pathogen for a liver abscess in East Asia including the Republic of Korea (ROK). Although gastrointestinal colonization of K. pneumoniae may lead to cross the intestinal barrier to invade the liver, characteristics of gastrointestinal carriage K. pneumoniae of hvKP liver abscess patients in the ROK are not well known. This study evaluated clinical and molecular epidemiological characterization of K. pneumoniae isolates obtained from the liver aspirate and the stool of the same hvKP liver abscess patient. Also, we assessed the potential roles of virulence factors and analyzed the pathogenicity of K. pneumoniae isolates. Methods: Characteristics of K. pneumoniae isolated from stool samples and liver aspirate samples of patients with hvKP liver abscess at a tertiary care hospital in the ROK between 2017 and 2018 were evaluated. Virulence factors of K. pneumoniae isolates obtained from the liver aspirate and the stool of the same hvKP liver abscess patients and other K. pneumoniae isolates available on the public domain were analyzed by a comparative genomic analysis including whole genome sequencing (WGS). The pathogenicity of K. pneumoniae isolates obtained from the liver aspirate, and the stool of the same hvKP liver abscess patient was assessed by the mouse inoculation model. Results: Out of 36 patients with hvKP liver abscess, 11 patients were noted to have K. pneumoniae isolated from stool samples and were enrolled for analysis. The median age was 71 years, and the majority of the patients (72.7%) were without significant underlying comorbidities. For hvKP isolates from the liver aspirate samples, the most frequent capsular serotype was K1 (72.7%) followed by K2 (27.3%). For K. pneumoniae isolates from the stool sample, the majority was non K1/K2 serotype (72.7%). Among non K1/K2 serotype isolates, the high variability of ST (sequence type) (ST15, ST307, ST37, ST273, ST2622, and ST42) with a high rate of presence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) (100.0%) was noted. The concordance rate of the K. pneumoniae strains between the liver aspirate sample and the stool sample from the primary hvKP liver abscess was low (27.3%). There was no significant difference in the distribution of the major virulence factors between K. pneumoniae isolates from the liver aspirate (KUH-L1, K1/ST23) and the stool sample (KUH-F1, K1/ST23) from the same hvKP liver abscess patient, However, there were different protein-coding genes (CDS) of metabolic pathways: presence of Pullulanase secretion protein PulS in the KUH-F1 and Protein-N(pi)-phosphohistidine-D-fructose phosphotransferase and Protein-N(pi)-phosphohistidine-L-ascorbate phosphotransferase in the KUH-L1 and other liver abscess hvKP isolates. The explanted liver tissues from mice with various doses of orally inoculated KUH-F1 demonstrated positive growth of K. pneumoniae in 6 mice liver tissue samples (6/21, 28.6%), whose phenotype was identical to KUH-F1. However, no growth of K. pneumoniae was noted in the explanted liver tissues from mice with various doses of orally inoculated KUH-L1 and KUH-F3 (KN2/ST307). Conclusion: This study suggests that significant heterogeneity of K. pneumoniae colonizing the intestinal tract of the hvKP liver abscess patients. Also, the most common type of the hvKP from the hvKP liver abscess in our study was K1/ST23, which had significant similarity to that of the reference strain of K1/ST23 (NTUH-2044), suggesting the clonal expansion of the hvKP liver abscess isolates in the ROK. Moreover, our genomic analysis and mouse oral inoculation experiment showed the specific difference in the distribution of CDSs among the K. pneumoniae isolates and disparate growth of the K. pneumoniae identified from the explanted mouse liver tissues, suggesting their possible contribution to the underlying mechanism of pathogenesis of the hvKP liver abscess.

more

목차

I. Introduction 1
Hypervirulent Klebsiella pneumoniae 1
Hypothesis 4
Objectives 5

II. Methods 6
Study population and bacterial isolates 6
Microbiological characterization 7
Mouse oral inoculation model 10
Statistical analysis 12

III. Results 13
Clinical characteristics 13
Microbiological characterization 13
Whole genome sequencing and comparative genomic analysis 15
Comprehensive phylogenetic analysis 20
Mouse oral inoculation model experiment 20

IV. Discussion 24

V. Conclusion 34

References 36

Tables 45
Table 1. Primers used for cps genotyping of Klebsiella pneumoniae 45
Table 2. Primers used for multilocus sequence typing (MLST) of Klebsiella pneumoniae 46
Table 3. A list of 19 Klebsiella pneumoniae isolates included for comparative whole genomic analysis 47
Table 4. Clinical characteristics of patients with liver abscess caused by hypervirulent Klebsiella pneumoniae 48
Table 5. Microbiological characteristics of Klebsiella pneumoniae isolates from liver abscess aspirates and stool samples from patients with liver abscess caused by hypervirulent Klebsiella pneumoniae 49
Table 6. Comparison of characteristics between the concordant and non-concordant group of Klebsiella pneumoniae isolates 52
Table 7-1. Mouse oral inoculation experiment using the liver aspirate of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolate (KUH-L1) 52
Table 7-2. Mouse oral inoculation experiment using the stool hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolate (KUH-F1) 54
Table 7-3. Mouse oral inoculation experiment using the stool non-hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolate (KUH-F3) 55

Figures 57
Figure 1. Phylogenetic tree of Klebsiella pneumoniae isolates of the liver aspirate and the stool sample from hypervirulent Klebsiella pneumoniae liver abscess patients 57
Figure 2. Whole genome of the liver aspirate Klebsiella pneumoniae isolate (KUH-L1; K1/ST23) 58
Figure 3. Whole genome of the stool Klebsiella pneumoniae isolate (KUH-F1; K1/ST23) 58
Figure 4. Heatmap of gene presence and absence among 19 Klebsiella pneumoniae isolates 59
Figure 5. Pairwise ortholog comparative analysis of the classes of virulence factors of 19 Klebsiella pneumoniae isolates 59
Figure 6. Venn diagram of protein-coding genes of the liver aspirate (KUH-L1) and the stool (KUH-F1) Klebsiella pneumoniae isolates from the same hypervirulent Klebsiella pneumoniae liver abscess patient 60
Figure 7. Venn diagram of protein-coding genes of the stool (KUH-F1) Klebsiella pneumoniae isolate from the hvKP liver abscess patient and liver aspirate Klebsiella pneumoniae liver isolates (KUH-L1, NTUH-2044m CG-43, and GN-2) from the hvKP liver abscess patients 60
Figure 8. Multilocus sequence typing (MLST) phylogenetic tree analysis of Klebsiella pneumoniae isolates 61

국문초록 62

more
반출 Meta View 목록