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Investigation of stereoselective activities of chiral drugs using cell lines

세포주를 이용한 chiral 약물들의 입체 선택적 활성 조사

초록/요약

제약 회사의 전통적인 연구 개발 의약품의 90 % 이상이 실패한다. 이는 제 약 연구 및 개발 비용이 천문학적인 이유 중 하나이다. 그러므로, Drug repositioning (Drug repurposing이라고도 함)은 기존 약물의 새로운 용도를 찾 는 과정으로 최근 몇 년 동안 많은 주목을 받고 있다. 이러한 Drug repositioning은 안전성 평가를 포함하여 전임상 및 임상 시험을 거친 약물의 새로운 용도를 발견하는 것이기 때문에 약물 개발에 필요한 비용과 시간을 포함한 다양한 노력을 줄일 수 있는 장점이 있다. 이와 관련하여 Drug repositioning을 위해 chiral 약물을 사용하려는 시도는 또 다른 합리적인 전략 으로 생각된다. 많은 약물들의 주성분은 하나의 특정 입체 이성질체 또는 입 체 이성질체 혼합물로서 존재하며 많은 연구가 chiral 약물의 활동과 부작용을 이해하기 위해 연구되었지만, 그 연구는 주로 약물이 승인된 질병에 초점을 맞춰 진행되어왔다. 본 연구에서는 fluoxetine과 atorvastatin과 같은 10 개의 chiral 약물의 stereotype들의 새로운 생물학적 활성이나 알려지지 않은 세포 독성을 발견하 고자 하였다. 신약 개발 초기 단계에서 후보 물질을 제거하는 것이 중요하기 때문에 다양한 in vitro 약물 screening 방법에서 세포 독성, 산화 스트레스 및 지방 세포 분화와 관련된 다양한 방법을 통해 chiral 약물의 활성 차이를 확인 하고자 한다. 테스트 한 10 개의 chiral 약물 중 fluoxetine과 atorvastatin은 기 존의 약효가 아닌 입체 선택적으로 세포 형태나 성장에 다른 영향을 나타냈 다. Fluoxetine은 선택적 세로토닌 재흡수억제제 (SSRI) 계열의 항우울제로서 중 추 신경계 질환에 미치는 영향 외에도 암에 효과가 있는 것으로 나타났지만, 이 약물의 stereotype들의 활성에 관한 제대로 된 연구는 아직 없다. 따라서 fluoxetine 입체 이성질체가 인간 암 세포 (PC-3, HCT-15, MDA-MB-231)의 분 화와 성장에 미치는 영향을 분석했다. 세포 성장 억제 분석에서 (R)-fluoxetine 은 10 M에서 보다 높은 세포 독성을 보인 반면, (S)-fluoxetine은 암 세포의 형태 변화를 유도했다. 그러나 fluoxetine 입체 이성질체는 WI-38과 같은 normal human fibroblast cell line에서는 독성이 없었다. (R)-fluoxetine은 poly (ADP-ribose) polymerase의 절단을 유도하고 Survivin의 발현을 감소시킴으로 써 (R)-fluoxetine이 암세포의 세포 사멸을 활성화시켰음을 시사한다. 이러한 세포독성은 fluoxetine 약물의 독성과 부작용에 영향을 미칠 수 있다. (3R, 5R)- 및 (3R, 5S)-Atorvastatin은 암세포인 PC-3, MDA-MB-231, HCT-15 세포에서 높은 성장 억제 효과를 보였고, 나머지 다른 입체 이성질체들은 효 과를 보이지 않았다. 콜레스테롤 합성 과정에서 HMG-CoA 환원 효소에 의해 생산되는 대사산물인 (R)-mevalonic acid의 감소가 암세포 성장 저해에 중요한 역할을 한다는 생각을 가지고 (R)- 또는 (S)-mevalonic acid를 atorvastatin 입 체 이성질체와 함께 치료하였다. (R)-mevalonic acid가 (3R, 5R)- 및 (3R, 5S)- atorvastatin에 의해 유도된 세포 성장 억제를 역전시키는 반면, (S)-mevalonic acid는 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 이러한 결과는 (3R, 5R)- 및 (3R, 5S)- atorvastatin이 유발한 암세포 성장 억제의 작용 메커니즘에 대한 더 깊은 이 해가 항암제의 분자 표적을 제공할 수 있음을 시사한다. 마지막으로 마우스 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 분화 유도가 chiral 약물의 stereotype들의 생물학적 활성 사이의 차이를 찾기 위한 screening 시스템으 로 사용되었다. 3T3-L1 세포의 분화는 atorvastatin의 stereotype인 (3R, 5R)- 및 (3R, 5S)-atorvastatin 이 억제되었지만 다른 두 가지 유형은 그렇지 않았다. HMG-CoA 환원 효소 억제를 통해 (3R, 5R)- 및 (3R, 5S)-atorvastatin에 의한 3T3-L1 세포 분화 억제가 일어났는지를 알아보기 위해 atorvastatin과 함께 (R)- mevalonic acid를 처리하였다. 암세포로 수행된 결과에서 볼 수 있듯이, (R)- mevalonic acid는 (3R, 5R)- 및 (3R, 5S)-atorvastatin에 의한 3T3-L1 세포 분화의 억제를 역전시켰다. 이러한 결과는 추가 연구가 필요하지만 (3R, 5R)- 및 (3R, 5S)-atorvastatin이 인체의 지방 세포 분화를 방해할 수 있음을 시사한다. 종합하면, 본 연구에서 사용된 cell assay system들은, 우리가 미처 예상하지 못하였던 chiral 약물들의 입체 이성질체들의 세포독성 혹은 다른 생물학적 활 성을 새로이 찾아내는데 기여할 수 있을 것으로 생각된다.

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초록/요약

More than 90% of pharmaceuticals currently under research and development by traditional pharmaceutical companies fail, which is why the cost of pharmaceutical research and development is astronomical. Therefore, drug repositioning (also called drug repurposing), the process of finding new uses of existing drugs, has been gaining a lot of attention in recent years. Since drug repositioning is to discover new uses of drugs that have already undergone preclinical and clinical trials, including safety assessment, there is high expectation for reducing a variety of efforts, including cost and time, that are needed in drug development. In this regard, an attempt using chiral drugs for drug repositioning is thought to be another reasonable strategy. The main components of many drugs are present as stereoisomers, which are as one specific stereoisomer or racemates. Many studies have been conducted to understand the activities and side effects of chiral drugs, but it appears that those studies have been mostly focused on the disease for which the drugs have been approved. In the present study, we tried to find new biological activity or unknown cytotoxicity of 10 chiral drugs, such as fluoxetine and atorvastatin. To identify if the stereoisomers of the chiral drugs have different biological activities, we investigated if the drugs induced any changes in the morphology and growth of a certain types of cancer cells. Among 10 chiral drugs tested, fluoxetine and atorvastatin showed different effects on the cell morphology or growth, depending on the stereotypes. Fluoxetine is an antidepressant of the selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) class. Fluoxetine has been shown to be effective against cancer in addition to its effects on central nervous system disorders. However, there is no study yet on the activity of each stereoisomer of this drug against cancer cells. Therefore, we decided to analyze the effect of fluoxetine stereoisomers on the differentiation / growth of human cancer cell (PC-3, HCT-15, MDA-MB-231). While cell growth inhibition assays showed that (R)-fluoxetine had higher cytotoxicity in 10 uM, (S)-fluoxetine induced changes in the morphology of cancer cells such as PC-3, MDA-MB-231 and HCT-15 cells. However, fluoxetine stereoisomers were not toxic to a normal human fibroblast cell line such as WI-38. (R)-fluoxetine induced the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase and decreased the expression of survivin in cancer cell cells, suggesting that (R)-fluoxetine activated apoptosis of the cells. This cytotoxicity might play a role in the toxicity of the drug fluoxetine in the body. (3R, 5R)- and (3R, 5S)-Atorvastatin showed higher growth inhibitory effects on in PC-3, MDA-MB-231, HCT-15 cancer cells and WI-38 cells, a normal fibroblast cell. To see if reduced production of (R)-mevalonic acid, the key metabolite intermediate produced by HMG-CoA reductase in the process of cholesterol synthesis, was a major event involved in the inhibition of cancer cell growth, (R)- and (S)-mevalonate was treated together with atorvastatin stereoisomers. While (R)-mevalonate reversed the (3R, 5R)- and (3R, 5S)-atorvastatin-induced cell growth inhibition, (S)-mevalonate did not show any effect. These results suggest that further understanding about the mechanism of action of (3R, 5R)- and (3R, 5S)-atorvastatin induced cancer cell growth inhibition may provide a molecular target for an anticancer drug. Finally, differentiation induction of mouse 3T3-L1 cells into adipocytes was used as a screening system to find any difference between biological activities of stereotypes of the chiral drugs. Differentiation of 3T3-L1 cells was inhibited (3R, 5R)- and (3R, 5S)-atorvastatin, a member of atorvastatin, but was not by the other two types. (R)-mevalonate was treated together with atorvastatin to see if the inhibition of differentiation of 3T3-L1 cell differentiation by (3R, 5R)- and (3R, 5S)-atorvastatin was occurred through HMG-CoA reductase inhibition. As was seen in the results conducted with cancer cells, (R)-mevalonate reversed the inhibition of 3T3-L1 cell differentiation by (3R, 5R)- and (3R, 5S)-atorvastatin. These results suggest that (3R, 5R)- and (3R, 5S)-atorvastatin may interferes with the differentiation of adipocytes in the human body although further study is needed. Taken together, our cell assay systems used in the present study may contribute to the reassessment of cytotoxic or other biological activities of stereoisomers of chiral drugs that we have not anticipated.

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목차

Ⅰ. General introduction -------------------------------------------------------------------------- 1
1. Drug repositioning --------------------------------------------------------------------------- 1
2. Stereochemistry in drug action ------------------------------------------------------------ 3
Ⅱ. Materials and Methods ------------------------------------------------------------------------ 5
1. Reagents ------------------------------------------------------------------------------------------ 5
2. Nitric oxide assay -------------------------------------------------------------------------------- 5
3. Cell growth inhibition assay ------------------------------------------------------------------- 6
4. Induction of adipocyte differentiation ------------------------------------------------------ 6
5. Adipocyte Oil Red O staining ----------------------------------------------------------------- 7
6. HMG-CoA reductase inhibition assay ------------------------------------------------------ 7
7. Reverse transcriptase (RT)-PCR -------------------------------------------------------------- 7
8. Western blotting analysis --------------------------------------------------------------------- 9
9. Immunocytochemistry ------------------------------------------------------------------------- 9
10. Statistics ---------------------------------------------------------------------------------------- 9
Ⅲ. Part 1 Screening of stereoselective biological activity of chiral drugs -------------- 10
1. Background ------------------------------------------------------------------------------------ 10
2. Results --------------------------------------------------------------------------------------- 13
2-1. Effect of chiral drugs on the morphology of cancer cells -------------------------- 13
2-2. Inhibition of nitric oxide production of RAW 264.7 cells by chiral drugs ------- 15
2-3. Effects of chiral drugs on the adipocyte maturation -------------------------------- 17
3. Discussion ----------------------------------------------------------------------------------- 21
Ⅳ. Part 2: Differential biological activity of fluoxetine stereoisomers ----------------- 22
1. Background --------------------------------------------------------------------------------- 22
2. Results ------------------------------------------------------------------------------------------- 24
2-1. Effect of (R)- and (S)-fluoxetine on the morphology of cancer cells ------------- 24
2-2. Effect of (R)- and (S)-fluoxetine on the proliferation of cancer cells ------------- 26
2-3. Expression of mRNAs of serotonin receptor subtypes in cancer cells ------------ 30
2-4. The mechanism of action of death of PC-3 cells by (R)-fluoxetine --------------- 32
3. Discussion ------------------------------------------------------------------------------------ 35
Ⅴ. Part 3: Differential biological activity of atorvastatin stereoisomers --------------- 36
1. Background------------------------------------------------------------------------------------- 36
2. Results ------------------------------------------------------------------------------------------ 40
2-1. Effect of atorvastatin stereoisomers on cancer cell growth ----------------------- 40
2-1-1. Effect on the morphology of cancer cells atorvastatin stereoisomers -------- 40
2-1-2. Effect on the proliferation of cancer cells atorvastatin stereoisomers -------- 43
2-1-3 The effect of atorvastatin stereoisomers on HMG-CoA reductase activity --- 49
2-1-4. Reversal of cell growth inhibition by (R)-mevalonic acid ------------------------ 51
2-2. Effect of atorvastatin stereoisomers on adipocyte differentiation --------------- 57
2-2-1. Effect of atorvastatin stereoisomers on differentiation of 3T3-L1 cells ------ 57
2-2-2. Reversal of inhibition of adipocyte differentiationn by (R)-mevalonic acid - 59
2-2-3. Mechanism of action of inhibition of 3T3-L1 cell differentiation by
(3R, 5R)- and (3R, 5S)-atorvastatin-------------------------------------------------- 64
3. Discussion ------------------------------------------------------------------------------------- 66
Ⅵ. Conclusion ------------------------------------------------------------------------------------ 68
Ⅷ. References ------------------------------------------------------------------------------------ 70
Abstract in Korean ------------------------------------------------------------------------------- 75

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