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Self-Priming Hairpin sequencing (SelPH-seq) with a high precision

  • 김서영 (생명환경과학대학원 분자진단생명공학과 분자진단생명공학전공)

초록/요약

With the rapid development of NGS technology, various researches on life sciences such as cancer treatment, infectious diseases, prenatal diagnosis, forensic medicine, etc. have been actively carried out, leading to many changes in medical development. Despite the technological advances of NGS, the error rate is as high as 0.1 ~ 1%, which is inevitable and considered to be a big problem. The major cause of error in NGS is the polymerase chain reaction step in the sample preparation, which results in the incorrect analysis due to the biased amplification of certain parts of the template DNA. This error may not be a problem when analyzing a single homogenous genome, but it is critical for de novo assembly and low frequency variation. For the heterogeneous cases, it is difficult to determine whether the observed mutation in the NGS analysis comes from NGS error or actual mutation, because somatic mutations have the characteristics of appearing at low or ultra-low frequency. Therefore, methods for precisely distinguishing them are required and are being developed steadily. We designed an easy, simple and innovative method and named it Self-Priming Hairpin sequencing (SelPH-seq). The designed SelPH-adaptor having a hairpin structure capable of self-priming is ligated to the duplex DNA fragment, finally resulting in one dsDNA molecule containing duplicated copies of one original sequence. This type of dsDNA structure enables efficient error-correction and reduces the biases occurring during NGS. Although SelPH-seq is similar to O2n-seq in the structure of prepared libraries, unlike O2n-seq using a circularization, SelPH-seq has no restriction on the length of DNA fragments. In addition, SelPH-seq does not require additional enzymes or treatments except the basic reagents for NGS library preparation and does not need to worry about errors or artifacts from DNA damage. Furthermore, SelPH-seq is remarkably user-friendly as it is easy to prepare SelPH-adaptors and adapt it to general NGS library preparation process.

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초록/요약

NGS 기술의 급격한 발전으로 암의 치료 및 연구에서부터 전염병, 산전진단, 법의학 등 생명과학에 관한 다양한 연구들이 활발하게 진행되고 응용되어 의학 발전에 많은 변화를 가져왔다. 그러나, NGS의 기술적 진보에도 불구하고 오류율은 0.1 ~ 1 % 정도로 이는 상당히 높은 수치이며 불가피하여 큰 문제가 되고 있다. NGS 오류의 원인 중 큰 부분을 차지하는 것은 시료준비 과정의 중합효소연쇄반응 단계이다. 주형DNA의 어느 특정 부분만 편향적으로 증폭하는 경향에 의해서 올바른 분석이 되지 않기도 하는데, 이러한 오류는 단일 종류로 이루어진 Genome을 분석할 때는 크게 문제가 되지 않으나 de novo assembly 및 저 빈도 변이의 경우에는 치명적일 수 있다. 실제 NGS 로 분석 시 관찰되는 돌연변이가 NGS 자체 오류에 의한 것인지 실제 돌연변이인 것인지 구별하기가 어렵다. 또 다수의 체성 돌연변이의 경우 양이 적거나 극히 낮은 빈도로 나타나는 특성을 갖기 때문에 이들을 완벽하게 식별하는 것이 쉽지 않다. 그래서 이를 정확하게 감별하기 위한 방법들이 요구되어지고, 꾸준히 개발되고 있다. 우리는 쉽고 간편하며 혁신적인 방법을 디자인하였고 이름을 Self-Priming Hairpin-seq(SelPH-seq)으로 명명하였다. Hairpin구조로 Self-priming할 수 있는 SelPH-adaptor를 제작하여 NGS adaptor처럼 Duplex DNA조각에 부착시키는 것을 시작으로 하여 마지막에는 원본 Duplex DNA조각의 Sense DNA와 Anti-Sense DNA 각각이 한 쌍의 Paired End reads를 갖게 된다. PCR 과정을 포함하긴 하지만 오직 1 cycle씩 단 2번만 진행하기 때문에 편향적인 증폭에서 오는 오류를 최소화하며 예방할 수 있고, Circular DNA 기반의 방법과 달리 DNA조각의 길이 제한이 없다. 또, 기존의 NGS 라이브러리 제작에 필요한 기본적인 Reagents를 제외하고는 추가로 필요한 Enzyme등의 사용이 없어 DNA 손상으로 인해 발생할 수 있는 오류 및 인공산물을 염려할 필요가 없다. 게다가 SelPH-adaptor 제작을 위한 Oligonucleotide만 준비한다면 누구나 쉽게 활용이 가능하다는 장점도 있다.

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목차

ABSTRACT Ⅰ
목차 Ⅲ
그림 목록 Ⅳ
표 목록 Ⅴ
약어 목록 Ⅵ
I. 서론 1
1. Next Generation Sequencing의 대두 및 그 중요성 1
2. Next Generation Sequencing의 문제점 및 한계점 2
3. 극복하기 위한 방법 3
4. SelPH-seq 소개 7
II. 재료 및 실험 방법 8
1. Self-priming 확인 8
2. SelPH-adaptor 제작 9
3. SelPH-seq Scheme 실험 9
4. SelPH-seq을 이용한 Yeast genome라이브러리 제작 17
III. 결과 및 고찰 23
1. Scheme 23
2. Artificial DNA 조각을 이용한 SelPH-seq 최적화 25
3. Yeast genome을 이용한 SelPH-seq검증 45
4. Sequencing 결과 확인 47
IV. 결론 50
V. 국문요약 52
VI. 참고문헌 54

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