Molecular characterization and metabolic analysis in somatic cell reprogramming
- 주제(키워드) Stem cell
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 유승권
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 2
- 학위구분 박사
- 학과 대학원 생명공학과
- 세부전공 동물생명공학전공
- 원문페이지 189 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000080001
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045932290
초록/요약
In 2006, Dr. Yamanaka group in japan reprogrammed differentiated somatic cells into undifferentiated embryonic cells called induced pluripotent stem cells (iPSCs) using four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Reprogramming technology can solve the problems of embryonic stem cells including immune rejection and ethical problem. Although iPSCs have great merits for these applications, the risk of tumor formation, unclear mechanism, and side effect of undifferentiated cell population should be considered for clinical applications. Thus, scientists developed alternative technology called ‘direct reprogramming’ or ‘direct conversion’ which convert some somatic cells to other desired cell types without passing through pluripotent stage. This approach has been expected for generating new cell sources for cell therapies, however, genetic factor-related technologies still have critical problem to induce genomic mutations triggering unexpected cellular alteration. To solve this problem, scientists developed new methods to convert cell fate using chemical cocktails which can regulate signal pathway, metabolic regulation and epigenetic modulation. This approach is useful to avoid genomic mutation, furthermore, helpful to clarify unsolved mechanism of reprogramming process. In Chapter I, this study shows that iPS-like cells (iPSLCs) were generated from mouse somatic cells in two steps with small molecule compounds. In the first step, stable intermediate cells were generated from mouse astrocytes by Bmi1. These cells called induced epiblast stem cell (EpiSC)-like cells (iEpiSCLCs) are similar to EpiSCs in terms of expression of specific markers, epigenetic state, and ability to differentiate into three germ layers. In the second step, treatment with MEK/ERK and GSK3 pathway inhibitors in the presence of leukemia inhibitory factor resulted in conversion of iEpiSCLCs into iPSLCs that were similar to mESCs, suggesting that Bmi1 is sufficient to reprogram astrocytes to partially reprogrammed pluripotency. Next, Bmi1 function was replaced with Shh activators (oxysterol and purmorphamine), which demonstrating that combinations of small molecules can compensate for reprogramming factors and are sufficient to directly reprogram mouse somatic cells into iPSLCs. The chemically induced pluripotent stem cell-like cells (ciPSLCs) showed similar gene expression profiles, epigenetic status, and differentiation potentials to mESCs. In Chapter II, this study shows that a combination of four chemical compounds resulted in cells directly acquiring a NSC identity; termed these cells chemically-induced NSCs (ciNSCs). ciNSCs expressed NSC markers (Pax6, PLZF, Nestin, Sox2, and Sox1) and resembled NSCs in terms of their morphology, self-renewal, gene expression profile, and electrophysiological function when differentiated into the neuronal lineage. Moreover, ciNSCs could differentiate into several types of mature neurons (dopaminergic, GABAergic, and cholinergic) as well as astrocytes and oligodendrocytes in vitro. These results suggest that stably expandable and functional ciNSCs can be directly reprogrammed from mouse fibroblasts using a combination of small molecules without any genetic manipulation. In Chapter III, to reveal the relationship of metabolism and stemness of human PSCs, this study analyzed glycine metabolism related genes in human PSCs and differentiated cells. Among these enzymes, Glycine decarboxylase (GLDC) is exclusively expressed in human PSCs. GLDC regulates self-renewal, differentiation and metabolic status of PSCs. Especially, knock down of GLDC by GLDC shRNA reduced glycolysis, which are known to be important for rapid proliferation in stem cells and cancer cells. Interestingly, GLDC expression is induced during early stage of cellular reprogramming process and regulated by Klf4, c-Myc and Slug. These data suggest that GLDC-mediated metabolic regulation is important for maintenance of stemness and regulated by pluripotent transcription factor Klf4. Taken together, these approaches can apply to reprogramming technology to regulate gene expression, modulate epigenetic state and establish genetic disease model without intrusion of transcription factors in host genome. Moreover, this study is expected to generate new sources of cell therapies and disease modeling providing platform to human application for future medicines.
more초록/요약
2006년 일본의 야마나카 교수 연구진은 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc의 4가지 전사인자를 사용하여 분화된 체세포를 배아줄기세포의 특성을 지니도록 하는 역분화 (reprogramming)에 성공하였다. 기존 배아줄기세포의 경우 임상 적용에 있어 면역 거부 반응이나 윤리적인 이슈가 한계점으로 알려져 왔기 때문에 이를 극복할 수 있는 역분화 기술은 줄기세포를 활용하는 각종 재생의학분야에서 각광받는 분야가 되었다. 하지만 많은 장점에도 불구하고 역분화 기술은 만능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)의 양성종양 (teratoma) 형성 가능성 및 역분화라는 현상의 메커니즘이 아직까지 과학적으로 완전히 규명되지 않았다는 단점이 존재한다. 다양한 연구자들은 역분화 기술의 임상적 이용을 위해 여러 가지 연구를 진행했으며 그 중 하나가 만능성 줄기세포 단계를 우회하여 양성종양 형성 가능성을 배제하는 직접적 역분화 (direct reprogramming or direct conversion) 기술이다. 또한 전사인자를 체세포의 유전체에 삽입하는 기존의 역분화 방식의 유전체 변이 문제를 해결하기 위해 이를 세포 내 다양한 신호전달 및 대사, 후성적 체계를 조절하는 저분자성 화학물질을 이용하여 역분화를 유도하는 연구도 진행되었다. 이런 연구접근 방식은 기존의 문제점에 대한 해결 방법을 제시하였을 뿐만 아니라 역분화 현상의 효율 증가 및 메커니즘을 규명하는데 기여하였다. 1장에서 본 연구는 마우스의 체세포에 저분자성 물질을 처리하여 만능성 줄기세포와 유사한 특성을 지닌 세포 (iPSLC)를 유도하는 방법에 대해 제시하였다. 먼저, Bmi1 유전자를 마우스 성상교세포 (astrocyte)에 처리하여 배반엽상피줄기세포 (epiblast stem cell)와 유사한 특성을 지닌 세포 (iEpiSCLC)로 유도하였으며 만들어진 세포가 배반엽상피줄기세포와 마커 유전자 발현, 후성적 상태 및 분화능력에서 공통점을 가지고 있음을 확인하였다. 다음 단계에서 iEpiSCLC에 저분자성 물질을 이용하여 MEK/ERK 경로 및 GSK3 경로의 활성을 저해하고 백혈별 억제 인자 (LIF)를 처리하여 iPSLC를 유도함으로써 Bmi1 유전자 및 저분자성 물질의 조합이 마우스 체세포를 역분화 시킬 수 있음을 확인하였다. 마지막으로 Bmi1 유전자의 발현이 Shh 활성제인 Purmorphamine 및 Oxysterol과 같은 저분자성 물질에 의해 대체될 수 있음을 확인하였으며 이를 이용하여 Bmi1 유전자 도입을 저분자성 물질로 완전히 대체한 iPSLC (ciPSLC)를 유도하였다. 만들어진 ciPSLC는 마우스의 배아줄기세포와 전체적 유전자 발현 상태, 후성적 상태 및 분화능력에서 유사한 형질을 보였다. 2장에서는 앞선 연구에 이어 마우스 체세포를 신경줄기세포로 전환하는 직접적 역분화를 수행하였다. 4가지 저분자성 물질인 A83-01, Thiazovivin, Valproic acid 및 Purmorphamine을 처리할 경우 마우스 체세포가 신경줄기세포로 유도됨을 확인하였고 해당 세포를 induced neural stem cell (iNSC)이라고 명명하였다. iNSC는 신경줄기세포 마커 유전자인 Pax6, PLZF, Nestin, Sox2 및 Sox1 유전자를 발현하였으며 형태학적, 자기재생능력 및 유전자 발현 패턴에서 신경줄기세포와 유사함을 확인하였다. 또한 iNSC는 전기생리학적 특성을 지닌 신경세포로의 분화가 가능하였으며 세분화된 성숙한 신경세포인 도파민신경세포, GABA신경세포 및 콜린신경세포 뿐만 아니라 성상교세포와 희소돌기아교세포와 같은 신경교세포로의 분화도 확인되었다. 따라서 특정 유전자의 체세포 내 도입 없이도 저분자성 물질의 조합만으로 신경줄기세포로의 직접적 역분화가 가능함을 본 연구에서 확인하였다. 3장에서는 분자 수준 (molecular level)에서 인간 만능성 줄기세포의 대사적 특성과 줄기세포능 (stemness)의 관계를 분석하였다. 글라이신 대사경로는 분화된 체세포에 비해 만능성 줄기세포에서 특이적으로 활성화되어 있으며 이를 조절하는 효소인 Glycine decarboxylase (GLDC) 또한 만능성 줄기세포에서 높게 발현됨을 확인하였다. GLDC의 높은 발현과 만능성 줄기세포의 줄기세포능과의 관계성을 규명하기 위해 shRNA 시스템을 이용하여 GLDC의 발현을 저해할 경우 만능성 줄기세포의 자기재생능력, 분화능력 및 대사적 상태에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 특히, GLDC의 감소는 종양세포나 줄기세포의 빠른 세포생장을 지원하는 해당작용 (glycolysis)을 저해를 유발하는 것으로 확인되었다. 또한 역분화 과정 중에서 GLDC의 발현은 역분화 인자인 Klf4 및 c-Myc의 조절을 받으며 Slug 유전자의 조절과 대치하는 것으로 보인다. 결과적으로 본 연구를 통해 GLDC 유전자를 기반으로 하는 대사적 조절이 줄기세포능의 유지와 유도에 중요한 역할을 할 수 있음을 확인하였다. 본 연구에서 다양한 과학적 접근법을 통해 분자 수준에서 줄기세포와 역분화 과정 내 특성을 규명할 수 있음을 확인하였다. 결과적으로 유전자의 발현 및 후성적 상태가 유전자 도입 없이 저분자성 물질의 조합을 통해 조절 가능하며 역분화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해 얻어진 세포 및 기술은 유전체 변이 가능성을 배제한 적합한 질병모델 수립과 임상 적용 가능한 세포치료제의 개발 플랫폼으로 활용될 수 있을 것이다.
more목차
LIST OF FIGURES ix
LIST OF TABLES xiii
ABBREVIATION xiv
ABSTRACT xv
국문 초록 165
Chapter I
Reprogramming of mouse somatic cells into pluripotent stem-like cells using a combination of small molecules
1. Abstract 2
2. Introduction 3
3. Materials and methods 6
3.1 Cell culture 6
3.2 Retroviral transduction 8
3.3 FACS analysis 8
3.4 RT-PCR and qRT-PCR 9
3.5 Western blot analysis 9
3.6 Alkaline phosphatase staining and immunocytochemistry 10
3.7 Microarray analysis 10
3.8 Bisulfite genomic sequencing analysis 11
3.9 ChIP assay 11
3.10 In vitro differentiation of iEpiSCLCs 11
3.11 Teratoma formation and chimera formation 13
4. Results 16
4.1. Induction of astrocytes to iEpiSCLCs with Bmi1 16
4.2. Generation of homogenous single cell-derived, GFP-tagged iEpiSCLC clones (GFP-iEpiSCLCs) 30
4.3. Generation of Oct4 promoter-derived GFP-iEpiSCLCs
(Oct4p-GFP-iEpiSCLCs) 34
4.4. Generation of iPSLCs from iEpiSCLCs 38
4.5. iPSLCs obtained from Bmi1-transduced MEFs cultured under NSC conditions and treated with 2i/LIF have pluripotent properties characteristic of mESCs 41
4.6. Generation of iPSLCs from MEFs by treatment with Shh agonists and 2i/LIF and culture under NSC conditions 43
5. Discussion 48
6. References 52
Chapter II
A combination of small molecules directly reprograms mouse fibroblasts into neural stem cells
1. Abstract 59
2. Introduction 60
3. Materials and methods 62
3.1 Isolation of MEFs and SKPs 62
3.2 Generation of ciNSCs and iPSCs 63
3.3 Differentiation of ciNSCs 64
3.4 Immunocytochemistry 65
3.5 RT-PCR and qRT-PCR 66
3.6 FACS analysis 67
3.7 Bisulfite genomic sequencing analysis 67
3.8 ChIP assay 68
3.9 Electrophysiological analysis 68
4. Results 70
4.1. Direct reprogramming of NSCs from MEFs using a combination of small molecules 70
4.2. ciNSCs exhibit similar characteristics to NSCs 82
4.3. ciNSC have a multipotent differentiation potential in vitro 86
4.4. Neurons derived from ciNSCs have functional properties in vitro 90
5. Discussion 93
6. References 96
Chapter III
Glycine decarboxylase has important role for maintenance and induction of stemness
1. Abstract 101
2. Introduction 102
3. Materials and methods 106
3.1 Cell culture 106
3.2 RT-PCR and qRT-PCR 106
3.3 Western blot analysis 107
3.4 Immunocytochemistry 107
3.5 Metabolome profile analysis 108
3.6 Generation of iPSC from fibroblast 109
3.7 Survival and proliferation rate assay 109
3.8 Gene Expression Omnibus (GEO) datasets analysis 109
3.9 ChIP assay 110
3.10 Promoter luciferase assay 110
3.11 Cloning assay 110
3.12 Teratoma formation 111
3.13 Annexin V/PI staining 111
4. Results 113
4.1. Serine/Glycine pathway-involving Enzymes and GLDC are highly expressed in hPSCs 113
4.2. Inhibition of GLDC activity suppresses self-renewal of hESCs 120
4.3. Transition of metabolic status by GLDC inhibition in hESCs 130
4.4. Early induction of GLDC is important for metabolic shift and cell survival during reprogramming process 137
4.5. Methylglyoxal clearance by AGE inhibitor LR-90 improves reprogramming efficiency 145
4.6. Klf4 and c-Myc regulate GLDC expression during somatic cell reprogramming 149
5. Discussion 154
6. References 159
