공진 주파수와 전압전류법을 이용한 단일염기변이와 극저 SNR DNA 검출
Single-Nucleotide Polymorphism and Low Signal-to-Noise Ratio DNA Detection Using Resonance Frequency and Voltammetry
- 주제(키워드) Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) , MutS , Resonator , Voltammetry , Detection , Gold nanoparticle (AuNP) , Signal-to-Noise Ratio , Epidermal growth factor receptor (EGFR) , Wild amplifier
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 나성수
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 2
- 학위구분 석사
- 학과 대학원 기계공학과
- 원문페이지 108 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000079567
- 본문언어 한국어
- 제출원본 000045932202
초록/요약
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) 와 Epidermal growth factor receptor (EGFR) 돌연변이는 비소 세포 폐암 (NSCLC) 에 대한 화학 요법 및 표적 치료에 있어서 중요한 지표다. 그렇기 때문에 KRAS 와 EGFR 돌연변이 검출을 위한 몇 가지 방법이 개발되었지만, 이 기술들은 복잡하고 또한 높은 비용이 요구되는 여러 단계의 증폭 사이클이 있기 때문에 새로운 탐지 방법을 개발하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 각각 KRAS 돌연변이의 고감도 검출을 위하여 MutS, 금 나노 입자 (AuNP) 및 마이크로 외팔보 공진기 (MCR) 를 사용 하였다. 또한 EGFR 을 효과적으로 검출 하기 위하여 별도 템플릿 DNA 와 전압전류법이 사용되었다. 이 중 MutS 는 DNA 손상 복구 효소 중의 하나로써 DNA 단일 염기 불일치에 부착하는 특별한 특징을 가지고 있다. KRAS DNA 의 대부분은 정상과 비교하여 단일염기변이를 가지고 있기 때문에 MutS 효소를 사용하여 KRAS 돌연변이 DNA 를 효과적으로 검출 할 수 있었다. 또한 질량 증폭에 의한 공진 주파수 변화를 극대화 하기 위하여 AuNP 를 사용 하였다. 위와 같은 방법으로 단일염기변이 DNA 검출에 있어서 100 fM 의 주목할만한 검출 한계를 얻을 수 있었다. EGFR 검출 시에는 전압전류법을 사용하여 1 fM 의 높은 민감도의 검출 한계를 달성하였고, 별도의 DNA 템플릿 구조를 추가하여 기존의 노이즈로 인식되던 정상 DNA 를 증폭제로 사용하는 구조를 사용하여 오히려 정상 DNA 와 변이 DNA 가 혼재되어 있는 용액에서 100 aM 의 높은 민감도를 달성하였을 뿐 아니라, 1 : 10^6 의 높은 변이 대 정상 DNA 검출 비를 달성 하였다. 마지막으로, 본 연구에서 제안 된 방법의 결과는 향후 암 환자 개개인에 특화된 의료 진단의 가능성을 보여준다.
more초록/요약
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) and Epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations are important markers for both targeted therapy and chemotherapy of non-small-cell lung cancer patients. In this study, we developed a highly sensitive and selective detection method that could discriminate between different KRAS mutations based on single-nucleotide mismatch recognition. A single mismatched base between the KRAS mutant DNA and probe DNA on the resonator induced MutS binding to the mismatched base. Given that MutS binds to the AuNP (MutS-AuNP), both MutS and AuNP were adsorbed to the resonator. Detection was based on the resonance frequency shift of resonator upon the adsorption of MutS-AuNP. As a result, AuNP, which act as mass amplifiers, allowed high-sensitivity detection of KRAS mutations, with the obtained LOD of 100 fM. Moreover, our proposed method successfully detected KRAS mutations in the presence of wild-type DNA with concentrations as low as 0.1% and was able to discriminate between different KRAS mutations. In the detection of EGFR, the 1 fM limit of detection was achieved using the voltammetry method. Using a normal DNA mediated chain like structure, which conventionally considered as noise. A high sensitivity of 100 aM is achieved in a mixed solution. Thus high mutation to normal DNA detection ratio of 1: 10^6 is performed. Thus, our proposed method demonstrated great potential for use in personalized medical diagnosis for cancer patients.
more목차
Abstract i
Table of Contents iii
List of Figures vi
List of Tables xi
제1장 서론 1
1.1 연구배경 1
1.2 연구목적 4
제2장 재료 및 실험방법 8
2.1 실험 재료 8
2.2 KRAS DNA 검출 센서 제작 12
2.3 MutS 와 AuNP 고정화 14
2.4 KRAS 변이 검출 실험 16
2.5 KRAS DNA 의 선택 성 실험 18
2.6 KRAS 검출 기본 조건 실험 18
2.7 KRAS DNA 의 구분 검출 실험 19
2.8 적은 개수의 DNA 검출 실험 21
2.9 EGFR 검출 샘플 준비 23
2.10 EGFR 검출 센서 제작 24
2.11 깁스 자유 에너지 26
2.12 WMSPA (정상 매개 자가 정제 증폭제) 제작 26
2.13 전압 전류법을 사용한 EGFR 변이 검출 실험 28
2.14 EGFR 검출 기본 조건 실험 35
2.15 EGFR DNA 의 선택 성 및 증폭 실험 35
제3장 단일염기변이 암 DNA 검출 실험 결과 37
3.1 KRAS DNA 검출 전략 37
3.2 원자력 현미경과 형광 현미경을 이용한 센서 제작 검증 41
3.3 MutS 와 금 나노 입자의 결합 검증 44
3.4 KRAS DNA 의 농도 별 검출 결과 49
3.5 KRAS DNA 검출 센서의 선택적 검출 결과 56
3.6 다른 종류의 KRAS DNA 구분 검출 결과 59
3.7 적은 개수의 DNA 검출 결과 61
제4장 극저 SNR 의 자가 정제 및 증폭 검출 실험 결과 63
4.1 EGFR DNA 검출 전략 63
4.2 센서 제작 검증 64
4.3 깁스 자유 에너지 66
4.4 WMSPA (정상 매개 자가 정제 증폭제) 제작 검증 69
4.5 기본 조건 실험 결과 72
4.6 EGFR 변이 DNA 검출 실험 결과 75
4.7 EGFR DNA의 선택 성 및 증폭 효과 실험 결과 79
제5장 결론 83
참고문헌 (References) 86
국문초록 (Korean Abstract) 91
감사의 글 93
