Structural study of the pleiotropic transcription regulator CodY
- 주제(키워드) Structural biology , transcrtiption factor , GTP-binding protein , metabolism regulation
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 황광연
- 발행년도 2017
- 학위수여년월 2017. 2
- 학위구분 박사
- 학과 대학원 바이오시스템공학과
- 세부전공 의생명시스템공학
- 원문페이지 136 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000071716
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045897383
초록/요약
Bacteria sense and respond to environmental status for their survival. So they use some small molecules as an indicator for the energy status to check nutrient availability. GTP and Branched Chain Amino Acids (BCAAs) are indispensable metabolic indicators for the determination of the nutritional status of cells. However, their molecular-sensing mechanism is unclear at a molecular level despite its importance. CodY is a transcription factor and a unique global regulator that responses GTP and BCAAs as specific metabolite signals and manages numerous genes associated with metabolism. Here, I report the first crystal structures of the full-length CodY and complex structure with GTP. I describe their functional states as a sensing molecule, GTP. I determined crystal structures with two different oligomeric states: a dimeric CodY complexed with two metabolites, GTP and isoleucine from Staphylococcus aureus (saCodY, Chapter I), and a tetrameric form (apo) of CodY from Bacillus cereus (bcCodY, Chapter II). Notably, the tetrameric state showed in an auto-inhibitory manner by blocking the DNA-binding site by itself, whereas the dimeric state showed clearly the binding site of GTP and isoleucine. Taken together, the structural and biochemical assays provide for better understanding how CodY senses GTP and operates as DNA-binding protein and pleiotropic transcription regulator.
more초록/요약
에너지원 이용가능 여부는 미생물에 환경에 대한 적응과 생존에 있어 매우 중요하다. 병원균의 경우 에너지원의 원활한 공급을 위해 병원성 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 관점에서 대사과정과 관련된 전사인자의 연구는 매우 중요하다. 미생물은 영양물질의 이용 가능성을 확인하기 위해서 몇 가지의 작은 물질들을 에너지상태의 지표로써 사용한다. GTP와 가지형 아미노산 (류신, 아이소류신, 발린)은 미생물 세포에서 세포의 영양상태를 결정하는 지표로서 이용된다. 그러나 그들의 분자 감지 기작은 중요성에도 불구하고 분자수준으로 확실하게 알려져 있지 않다. 글로벌 전사 조절 인자는 대사 산물을 신호로 감지하여 다양한 유전자를 조절하는 인자로 코디 단백질(CodY, 코디)은 그람 양성균에만 특이적으로 존재하는 글로벌 전사 조절 인자이다. 코디는 GTP와 가지형 아미노산을 대사산물 신호로 감지하고 이용해서 세포 내 대사과정과 관련된 200여개의 유전자를 직접 혹은 간접적, 계층적으로 다발성으로 조절한다. 기존의 코디의 분자구조는 그 도메인에 따라 대사산물결합부위와 DNA 결합부위로 분리되어 보고되었다. 그리고 가지형 아미노산에 대한 반응기작 역시 분자수준으로 연구 보고 되었다. 코디의 가장 중요한 특징 중의 하나는 가지형 아미노산뿐만 아니라 추가적으로 GTP 가수분해 반응 없이 GTP를 신호로서 감지하는 것이다. 그러나 그 중요성에도 불구하고 정확한 GTP 반응 기작에 대한 분자수준의 연구는 보고된 적이 없었다. 정확한 GTP 결합부위와 코디의 전체 구조를 규명하기 위해서 본 연구에서는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)와 바실러스 세레우스균 (Bacillus cereus) 유래의 코디를 분리 정제하여 구조 연구를 수행하였다. 연구 결과 처음으로 코디의 전체구조와 GTP 결합부위를 규명하였으며 코디의 분자구조가 GTP 결합여부에 따라 달라진다는 사실을 발견하였다. 추가적인 생화학실험을 통해 코디의 DNA에 대한 활성은 GTP에 의해 촉진되며 GTP 결합부위가 DNA에 대한 코디 활성에 영향을 준다는 것을 알아냈다. 또한 GTP 결합 코디 구조와 비결합 코디 구조의 비교를 통해 어떻게 코디가 GTP를 사용하여 활성을 촉진시키는지에 대한 가설을 제시하였다. 이러한 코디의 반응 메커니즘은 미생물의 에너지 공급에 따른 대사과정 조절에 대한 이해를 높여줄 뿐만 아니라 병원균의 병원성을 조절하는 관점의 새로운 항생물질 개발에의 적용도 기대된다.
more목차
Abstract I
Table of Contents III
List of Tables VII
List of Figures VIII
Abbreviations XII
Preface 1
Chapter 1. Structural studies of pleiotropic repressor CodY from Starphylococcus aureus (saCodY) 11
1. Introduction 12
2. Materials and Methods
2.1. Cloning, protein expression and purification 16
2.2. Crystallization and data collection 17
2.3. Structure determination and refinement 18
2.4. Site-directed mutagenesis 22
2.5. Ultraviolet induced cross-linking [α-32P] GTP binding assay 23
2.6. Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis 24
2.7. Preparation Oligonucleotides and Electrophoretic Mobility Shift Assays 25
3. Results and Discussion
3.1. Overall structure of saCodY 27
3.2. Isoleucine binding sites of saCodY 32
3.3. GTP binding sites of saCodY 34
3.4. GTP binding affinity of saCodY 43
3.5. The implication of GTP binding for DNA binding activity of saCodY 49
4. Conclusion 54
Chapter 2. Structural studies of pleiotropic repressor CodY from Bacillus cereus (bcCodY) 55
1. Introduction 56
2. Materials and Methods
2.1. Cloning, protein expression and purification 58
2.2. Crystallization and Data collection 59
2.3. Structural determination and refinement 60
2.4. Size exclusion chromatography 63
3. Results
3.1. Overall structure of bcCodY 64
3.2. Tetrameric interface of bcCodY 69
3.3. Oligomeric state of CodY 73
3.4. Metabolite binding site of bcCodY 78
3.5. Structural comparison of domains of CodY 81
3.6. Structural comparison of full length CodY 85
4. Conclusion 88
Discussion
1. CodY which cannot bind with GTP 89
2. Proposed mechanism of CodY by GTP 91
Conclusion 95
References 97
Abstract in Korea (국문 초록) 108
Published journals 111
감사의 글 119
