RaoN, a Novel Non-Coding RNA, Induces Resistance to Macrophage-Related Stresses in Salmonella
- 주제(키워드) Salmonella , Non-coding RNA , Marophage , Acid stress , Oxidative stress
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 박용근
- 발행년도 2014
- 학위수여년월 2014. 2
- 학위구분 박사
- 학과 일반대학원 생명과학과
- 세부전공 분자생물학 전공
- 원문페이지 115 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000048983
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045793054
초록/요약
살모넬라는 병독성 및 병인기작으로서 잘 알려진 세균성 병원균이다. 대식세포의 선천면역반응에 저항하기 위해 다양한 방어메카니즘을 가진다. 수 많은 반응 중에 단백질의 발현, 조절, 기능등에 관한 연구가 많이 진행되는 동안에도 살모넬라는 알엔에이(RNA)를 통해 조절하는 기작은 잘 알려지지 않았다. 본 연구는 small non-coding RNA (sRNA)를 매개로 한 새로운 개념의 대식세포내 병독성조절 메카니즘을 규명하는 것이다. 이 sRNA 조절자는 단백질을 암호화하지는 않으나, 외부 환경변화에 대응하여 전사후단계에서 mRNA에 결합함으로써 단백질의 활성과 mRNA의 해독 및 안정성을 조절하는 기능을 수행한다. 본 연구는 새로운 sRNA RaoN (RNA involved in response to acid and oxidative stress during nutrient limitation)의 target 유전자 및 작용 메카니즘을 밝혀냈다. Transposon을 이용하여 산성 pH에 민감한 돌연변이를 선별하였으며 동시에 산화스트레스와 산화질소스트레스 극복에도 관여함을 알게 되었다. 흥미로운 것은 이 돌연변이 균주에서 transposon은 두 유전자 사이 (intergenic region)에 존재하였으며 Northern blot 과 RT-PCR을 이용하여 이 지역에서 단백질을 암호화하지 않는 non-coding RNA 유전자가 존재함을 확인하였다. intergenic transcript의 target 유전자를 찾기 위해 야생형과 knockout 돌연변이 균주를 이용하여 microarray 분석을 수행한 결과, 젖산 탈수소효소A 유전자의 발현 차이를 확인하였다. 숙주의 면역세포인 대식세포는 침입한 살모넬라를 포식하게 되며, 이를 분해하기 위해 매우 높은 반응성을 가지는 ROS (Reactive Oxygen Species)와 RNS (Reactive Nitrogen Species)를 생산한다. 그리고 대식세포내파고좀(phagosome)의 pH는 4-5 정도로 세균의 생존을 위협한다. 하지만, 살모넬라는 대식세포내 환경에 적응하여 정교한 증식, 생존 방법을 진화시켜왔다. RaoN sRNA와 젖산 탄수소효소A 유전자의 관계를 증명하기 위해 대식세포 감염 실험을 실시하였으며 RaoN 돌연변이 균주에서는 젖산 탈수소 효소A 유전자가 과발현함으로써 산성상태의 파고좀을 극복하지 못한다. 그러므로 sRNA는 target 유전자 조절에 관여하여 대식세포내 생존에도 기여함을 확인하였다. 또한 새로운 non-coding RNA의 살모넬라 병독성 참여 여부를 조사하기 위해 야생형 살모넬라와 각 돌연변이주들은 구강을 통해 mouse에 감염시키고 치사율을 측정하였고, 살모넬라의 조직 침투 정도를 비교하기 위해 감염 후 비장과 간을 적출하여 세균 수를 비교하여 병독성 정도를 측정결과 돌연변이 균주에서 병독성이 약화되었다는 것을 확인 할 수 있었다. 살모넬라 병원균의 대식세포내 생존에 기여하는 새로운 sRNA 연구를 통해 지금까지 알려진 생존메카니즘과는 차별성을 가지는 새로운 예를 제시할 수 있으며, 산성 pH, 산화스트레스, 산화질소 스트레스 모두에 관여하기 때문에 약독화 살모넬라 병독성 모델에서 새로운 sRNA의 영향 및 약독화균주로의 활용 가능성을 확인하였다.
more목차
Chapter 1
A Novel Noncoding RNA from Salmonella Counteracts the Macrophage Innate Immune Response………………………1
1.1 Abstract…………………………………………………2
1.2 Introduction……………………………………………3
1.3 Materials and Methods…………………………………7
1.3.1 Bacterial strains, media, and growth conditions…7
1.3.2 Construction of S. enterica serovar Typhimurium strains………………………………………………10
1.3.3 Plasmid construction………………………………10
1.3.4 Random transposon mutagenesis and screening…13
1.3.5 RNA isolation and Northern blot analysis………14
1.3.6 5′- RACE……………………………………………15
1.3.7 Disk diffusion assays………………………………16
1.3.8 Macrophage infection and survival assay………....16
1.3.9 Mouse Virulence Assays……………………………17
1.4 Results
1.4.1 Identification of a novel sRNA that contributes to survival under conditions of nutrient limitation and acid stress……………………………………………19
1.4.2 RaoN is strongly induced by combined treatment with nutrient and oxidative stress…………………25
1.4.3 RaoN contributes to resistance to oxidative stress, particularly when combined with nutrient limitation. ………………………………………………………35
1.4.4 RaoN is required for S. enterica serovar Typhimurium replication within murine macrophages……………………………………… 40
1.4.5 RaoN is required for S. enterica serovar Typhimurium virulence in mice……………………45
1.5 Discussion……………………………………………49
1.6 Reference…………………………………………52
Chapter 2.
Lactate Dehydrogenase A Upregulated in the RaoN Knockout Mutant Renders Salmonella Sensitive to Macrophage-Induced Stresses…………………………………………………………62
2.1 Abstract…………………………………………………63
2.2 Introduction……………………………………………64
2.3 Materials and Methods…………………………………66
2.3.1 Bacterial strains, media, and growth conditions…66
2.3.2 Construction of S. enterica serovar Typhimurium strains………………………………………………69
2.3.3 Plasmid construction……………………………… 72
2.3.4 RNA isolation and Northern blot analysis………72
2.3.5 Microarray analysis………………………………74
2.3.6 Microarray data accession number………………75
2.3.7 Quantitative real-time RT-PCR……………………75
2.3.8 Immunoblot analysis………………………………75
2.3.9 Macrophage infection and survival assay…………76
2.3.10 Disk diffusion assays………………………………77
2.4 Results
2.4.1 Transcriptome analysis……………………………79
2.4.2 A raoN null mutant displays increased expression of the ldhA gene under oxidative stress conditions…82
2.4.3 ldhA expression in Salmonella enterica do not induce catalase at oxidative stress…………………………85
2.4.4 Balanced expression of ldhA is necessary for survival under conditions of oxidative stress, particularly combined with nutrient limitation…………………88
2.4.5 Elevated expression of ldhA is responsible for the sensitivity to macrophage-related stresses in the raoN mutant…………………………………………91
2.5 Discussion………………………………………………93
2.6 Reference……………………………………………….95
Abstract in Korean……………………………………………99
