Novel Tetracycline Resistance Plasmids Recovered from Activated Sludge: Plasmid Genome, Impact on Bacterial Physiology, and Bioreporter Application
- 주제(키워드) Novel Tetracycline Resistance Plasmids from Activated Sludge
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 박우준
- 발행년도 2014
- 학위수여년월 2014. 2
- 학위구분 석사
- 학과 일반대학원 환경생태공학과
- 세부전공 생물재료공학
- 원문페이지 161 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000048820
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045793866
초록/요약
We used culture-dependent and culture-independent methods to extract novel plasmids harboring tetracycline (TC) resistance genes from activated sludge. The extracted plasmids were transformed into naturally competent Acinetobacter oleivorans DR1 to develop a novel non-Escherichia coli-based plasmid. Restriction length polymorphism performed using 30 transformed cells showed 4 different types of plasmids. Illumina-based whole sequencing of the 4 plasmids identified 3 novel plasmids and 1 previously reported plasmid. All plasmids carried TC resistance-related genes (tetL, tetH), tetracycline transcriptional regulators (tetR) and mobilization-related genes. Three novel plasmids showed mosaic gene acquisition through horizontal gene transfer. Membrane fluidity, hydrophobicity, biofilm formation, motility, growth rate, sensitivity to stresses, and quorum sensing signals of the transformed cells were different from those of the wild-type cells. Our data showed that acquisition of TC resistance through plasmid uptake is related to loss of biological fitness. Thus, cells acquiring antibiotic resistance plasmids can survive in the presence of antibiotics, but must pay ecological costs. A TC-inducible promoter, tetH promoter, and a TetR repressor of the pAST2 plasmid recovered from sludge were used to construct plasmid-based and chromosome-based bioreporters. Tetracycline (TC)-sensing bioreporters using green fluorescent protein (GFP) were generated in Escherichia coli and solvent-tolerant Acinetobacter oleivorans. Two host plasmids with a broad range, pRK415 and pBBR1MCS2, and three randomly chosen chromosomal sites were used to create the reporter strains. The data reflected mosaic evolution of the constructed plasmids, suggesting that the plasmid replication efficiency and the tetH promoter strength differed in the two different hosts. Among the tested TC compounds, doxycycline (DC) was the most effective in promoting GFP expression. E. coli- and A. oleivorans-based plasmid reporters could detect 5 nM and 30 nM DC, respectively. Insertion of the GFP reporter into different positions of the A. oleivorans chromosome resulted in variations of GFP expression. Furthermore, our stable A. oleivorans chromosomal bioreporter was functional in the presence of toxic organic solvents.
more초록/요약
Acinotobacter oleivorans DR1은 환경으로부터 이동 유전 요소인 플라스미드와 같은 외부 DNA를 잘 수용하는 것으로 알려져 왔다. 본 연구에서는 범용적으로 사용하고 있는 항생제인 테트라사이클린에 대한 저항성 플라스미드를 활성슬러지로부터 비배양 및 배양법으로 추출하여, A. oleivorans DR1 균주에서 성공적으로 복제가 가능한 새로운 플라스미드를 선별하였다. 제한효소단편길이다형성 분석을 통해 총 4가지의 플라스미드가 다른 종류로 확인되었으며 플라스미드를 전체를 시퀀싱하여 그 중 3가지가 새로운 플라스미드라는 것을 밝혔다. 유전체 분석 결과, 모든 플라스미드가 테트라사이클린 저항성 유전자를 보유하였으며 일부 플라스미드는 tetH유전자와 그의 억제 인자로 작용하는 transcriptional regulators (tetR)와 같이 존재하였다. 플라스미드에 의한 항생제 저항성 획득은 host 균주인 A. oleivorans DR1에 생리, 형태학적 변화를 주는 것을 확인하였으며, 생물학적 적응도가 달라지는 것이 관찰되었다. 특히 운동성의 감소, 생물막 형성 능력 저하, 균체밀도감지 시스템의 자가유도인자 신호 감소, Hexadecane 분해능 감소 등 뚜렷한 생태적 비용을 치르는 것으로 확인이 되었다. 나아가 본 연구는 환경으로부터 획득한 테트라사이클린 저항성 유전자를 전사융합으로 재조합하여 테트라사이클린 계열의 항생제가 있을 시 녹색 형광을 발하는 민감한 바이오리포터를 제작하였다. 제작된 바이오리포터는 제 2차 합성물질인 테트라사이클린 계열의 독시사이클린을 제일 잘 탐지하는 것으로 나타났다. 또한 유기 용매에 내성이 있는 A. oleivorans DR1 균주와 일반적으로 리포터 제작에 사용되는 E.coli 균주를 비교하여 host에 따른 장단점을 비교해보았다. 그 결과 유기용매에 노출된 조건에서 독시사이클린의 탐지는 A. oleivorans DR1 균주가 월등한 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서는 환경으로부터 획득한 테트라사이클린의 저항성 플라스미드가 cell에 미치는 영향뿐 아니라 이와 같은 유전자를 응용하여 환경에 적용하기 위한 정보를 제공하고 있다.
more목차
ABSTRACT ⅰ
ACKNOWLEDGEMENTS ⅵ
CHAPTER 1. GENERAL INTRODUCTION 1
1.1. INTRODUCTION 2
1.2. OBJECTIVES OF THE STUDY 5
1.3. REFERENCES 7
CHAPTER 2. Novel Plasmids Recovered from Activated Sludge Confer Tetracycline Resistance and Phenotypic Changes to Acinetobacter oleivorans DR1 12
2.1. INTRODUCTION 13
2.2. MATERIALS AND METHODS 16
2.3. RESULTS 30
2.4. DISCUSSION 61
2.5. REFERENCES 66
CHAPTER 3. TetR repressor-based bioreporters for the detection of doxycycline using Escherichia coli and Acinetobacter oleivorans 78
3.1. INTRODUCTION 79
3.2. MATERIALS AND METHODS 82
3.3. RESULTS 96
3.4. DISCUSSION 128
3.5. REFERENCES 133
CONCLUDING REMARKS 143
