신경전달물질(Glycine) 항상성 변화에 의한 알츠하이머병의 병리학적 기전 규명
- 주제(키워드) 알츠하이머 , 아밀로이드-베타 , 신경전달물질 , glycine
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 송문정
- 지도교수 김영수
- 발행년도 2013
- 학위수여년월 2013. 2
- 학위구분 석사
- 학과 일반대학원 생명공학과
- 세부전공 분자생물공학전공
- 원문페이지 58 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000039496
- 본문언어 한국어
- 제출원본 000045746063
초록/요약
알츠하이머병(Alzheimer’s disease, AD)은 한때 정상 노화 과정으로 인식 되었으나 Alzheimer가 환자의 뇌 조직에서 노인성 반(amyloid plaque)과 신경섬유 다발 (neurofibrillary tangles)을 발견하면서 정상적인 노화 과정과는 다름이 증명되었다. 독성을 갖는 베타-아밀로이드(beta-amyloid, Ab)의 축적으로 형성된 plaque가 뇌세포 사멸을 일으켜 뇌의 구조적 변화가 나타나며, 과다축적에 의해 astrocyte와 microglia가 활성되어 염증 유발 cytokine을 발현시켜 염증반응을 일으킴으로써 신경 세포독성을 일으킨다. 최근까지 AD 연구들은 환자의 뇌에 축적되는 Ab가 질병의 시작과 진행에 필수적인 인자로 밝혀지면서 Ab응집 저해, 생성 억제, 백신 등의 연구가 많이 이루어지고 있다. 하지만 Ab가 AD 발병보다 20-30년 앞서 생성되는 비 이상적 발생 원인과 급진적 진행의 기전은 연구된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 Ab생성과 응집 기전을 규명하기 위해 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에 존재하는 신경전달물질이 Ab조절에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. AD진행에 비례하여 뇌 속의 신경전달물질 변화가 일어나며 그중 glycine이 정상인에 비해 높은 수치로 확인되고 있다. 또한 이 증가가 뇌에서 학습과 기억을 담당하는 cortex와 hippocampus에서 특이적으로 나타남으로써 AD의 진행과 glycine이 밀접한 연관성을 갖는 것으로 생각되어 Ab비 이상적 생성, 집적의 매개체 역할을 할 것으로 가정하여 연구를 진행하였다. 우선 SPR을 이용하여 Ab와 glycine의 직접적인 상호작용을 확인 하였고, ThT assay, SDS-PAGE, TEM analysis, MTT assay 등의 in vitro 실험을 통해 glycine이 Ab의 응집 및 신경독성 유발을 촉진하여 neurodegeneration을 가속화함이 확인되었다. 또한 급성AD 동물 모델을 이용하여 학습과 기억력 손상을 확인하였는데 Y-maze task 결과 glycine 조건에서 응집된 Ab가 61%로 대조군(66%)에 비해 공간 지각 능력이 저하됨을 관찰할 수 있었다. Glycine 항상성 변화에 따른 실험은 급성 AD 동물 모델과 유전자 변형 동물 모델에 glycine을 섭취시킨 후 행동실험과 면역조직화학염색법을 이용하여 확인하였다. Glycine이 체내 과다로 존재할 때 급성 AD 모델은 대조군(52%)보다 낮은 수치인 28%로 유의성 있는 감소를 확인할 수 있었다. 또한, 유전자 변형 동물 모델에 glycine을 과다 섭취시킨 후 뇌의 변화를 면역조직화학염색법으로 확인한 결과 glycine을 섭취한 군에서 빠른 Ab plaque 증가를 확인할 수 있었으며, astrocyte도 Ab plaque 주변으로 모여 활성된 것이 확인되었다. 본 연구에서는 신경전달물질 glycine의 항상성 변화가 Ab 응집을 유도하고, 신경세포 사멸을 일으켜 학습과 기억능력의 저하를 유도하는 것을 확인하였다. 따라서, AD 환자의 신경전달물질의 항상성 변화가 질환의 진행에 근원적인 영향을 끼침을 밝히고, 더 나아가 AD에서 신경세포-신경세포 상호전달 이상에 의한 신경전달물질 변화를 확인해야 할 것이다.
more목차
1. 서 론 ………………………………………………………….. 1
2. 연구 재료 및 방법 ………..…….…………………………. 8
2.1. 연구재료 …………………………………………………… 8
2.2. A(1-40) 합성 ………………………………………………. 9
2.3. A(1-40) 처리 방법 ………………………………………… 9
2.4. 생체 외에서 A(1-40) 응집 유도 실험 ............................ 10
2.4.1. Surface plasmon resonance …………...……………………….. 10
2.4.2. Thioflavin T assay …………...……………………………….. 11
2.4.3. SDS-PAGE …………………………………………………. 11
2.4.4. Transmission electron microscopy ……………….…………….. 12
2.4.5. Primary cell culture …………………………………………. 13
2.4.6. MTT assay …………………………………………………. 13
2.5. 급성 AD 동물 실험 ……………………...……………….. 14
2.5.1. AD acute mouse ……………………………………………... 14
2.5.2. ELISA assay ………………………………………………… 15
2.5.3. Y-maze task ………………………………………………….. 16
2.5.4. Passive avoidance task ………………………………………… 16
2.6. 유전자 변형 AD 동물 실험 …………..……………..…….. 17
2.6.1. Transgenic mouse ……….…………………………………… 17
2.6.2. ELISA assay ………………………………………………… 18
2.6.3. Immunohistochemistry ……………………………….……….. 18
3. 결 과 ……………………………………………………………. 20
3.1. 생체 외에서 A(1-40) 응집 유도 실험 …………….…… 20
3.1.1. Surface plasmon resonance …………………………………..... 20
3.1.2. Thioflavin T assay ……………………………..……….…….. 22
3.1.3. SDS-PAGE …………………………………………...……. 24
3.1.4. TEM analysis ………………………………………………… 26
3.1.5. Cell viability assay ……………………………………………. 28
3.2. 급성 AD 동물 실험 …………………….………….……… 30
3.2.1. ELISA assay ……………………………………………….. 30
3.2.2. Y-maze task …………………………………………………... 32
3.2.3. Passive avoidance task ……………………………………….. 34
3.3. 유전자 변형 AD 동물 실험 ….……...…………………….. 36
3.3.1. ELISA assay ……..………………………………………….. 36
3.3.2. Immunohistochemistry ……………….………………………... 38
4. 고 찰 ……………………………………………………………. 41
5. 참고문헌 ………………………………………………………… 47
