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Effects of spinal NMDA NR2B-mediated signaling on neuropathic pain in a rat model of peripheral neuropathy

  • 김영경 (대학원 의학과 신경생물학전공)

초록/요약

말초신경 손상 후 신경병증성 통증이 유발되고, 유지되는 기전으로 척수후각에 존재하는 신경세포의 중추감작화(central sensitization)가 가장 많이 받아들여지고 있으며, 이는 장기강화와 유사한 기전이다. NMDA 수용체는 해마에서 장기강화(LTP)와 시냅스가소성에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 신경손상 후 NMDA 수용체를 억제시키면 신경병증성 통증의 증상은 줄어들지만, 심한 부작용이 동반되기 때문에 일반적으로 사용할 수 있는 약물은 아니다. NMDA 수용체의 아형 중 NR2B는 전뇌와 척수 후각의 표층에 존재하고 있고 운동기능을 담당하는 영역에서의 발현이 적기 때문에 NR2B를 억제시켰을 때 유사한 정도의 진통효과를 내면서, 부작용이 적을 수 있을 것으로 보이지만, 몇몇 연구에서는 그렇지 않다고도 한다. 또한 NR2B는 다른 아형에 비하여 C-말단이 길어 다양한 인산화 부위가 있기 때문에 세포 내 신호전달에 유리하고, 시냅스 후 밀집체(PSD)에 존재하면서 scaffold 단백질인 PSD-95와 상호작용을 갖고 있다. 그렇기 때문에 NMDA 수용체를 통하여 증가된 칼슘이 CaMKII나 PKC와 같은 인산화효소를 활성시키고, 인산화된 NR2B는 병적통증과 관련된 여러 단백질들을 연결시켜주는 PSD-95와 상호작용을 갖게 되어 이를 통해 신경병증성 통증이 유지되는 것으로 보인다. 따라서, 본 연구에서 NR2B와 관련된 신호전달이 신경병증성 통증에 미치는 영향에 대하여 연구하였다. 180-200g의 흰 쥐를 사용하였고, isoflurane을 이용한 흡입마취로 쥐를 마취시킨 후 L5 척수신경을 묶어 신경병증성 통증 모델을 만들었다. 손상 받은 쪽의 L5 척수후각을 적출하여 NR2B 및 NR2B 인산화부위(Ser1303, Tyr1472), CaMKII, PKC, PSD-95의 발현변화를 western blot으로 분석하였고, 이들을 억제시키는 약물을 척수강 내로 투여하여 발에서의 진통효과를 알아보았다. 면역침강법으로 NR2B의 인산화 부위 중 Ser1303과 Ser/Thr kinase인 CaMKII와 PKC의 상호작용을 확인하였고, CaMKII와 PKC를 억제시킨 후 Ser1303과 PSD-95의 상호작용의 변화를 알아보았다. 그 결과, NR2B 단백질 발현은 손상후기보다 손상초기에 많이 발현되었으나 NR2B Ser1303은 손상후기까지 인산화가 증가되어 있었고, NR2B antagonist인 Ro 25-6981의 진통효과는 초기에 비해 후기에 줄어들었다. NR2B 자체는 손상초기에 관여하고 있지만, NR2B와 관련된 신호전달은 손상후기까지 관여하고 있는 것으로 보고, Ser1303를 인산화 시키는 효소를 찾기 위하여 CaMKII과 PKC를 분석하였다. CaMKII는 손상전과 비교하여 단백질 발현량에 큰 차이가 없었으나, 자가인산화 형태인 Thr286은 손상 초기에 인산화가 증가되어 있었고, PKC는 손상 후기에 발현량이 증가되어 있었다. Ser1303과 CaMKII의 상호작용 또한 손상 후기보다는 손상초기에 증가되어 있었고, CaMKII 억제제의 진통효과도 초기보다 후기에 줄어들었다. Ser1303과 PKC의 상호작용은 초기에는 전혀 없었으나 후기에 약하게 상호작용을 갖고 있었고, PKC 억제제를 초기에 투여하였을 때 보다 후기에 투여하였을 때 진통효과가 더 컸지만, 의식수준에 대한 부작용이 있었다. Ser1303과 kinase의 상호작용이 NR2B와 PSD-95간의 상호작용에 미치는 영향을 알아보기 위해 CaMKII와 PKC의 억제제를 투여한 후 Ser1303과 PSD-95의 상호작용을 분석하였다. CaMKII를 억제시키면 Ser1303과 PSD-95의 상호작용이 줄어들었으나, PKC를 억제시켰을 때는 Ser1303과 PSD-95의 상호작용에 변화가 없었다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, NR2B는 손상후기보다 손상전기에 좀더 관여하고 있고, NR2B Ser1303과 PSD-95는 손상후기까지 증가된 상호작용을 하고 있으며, 이에 CaMKII가 관여하고 있음을 알 수 있다. 따라서, 신경병증성 통증이 장기간 조절되지 않으면서 유지되는 것이 Ser1303과 PSD-95의 증가된 상호작용 때문으로 추정할 수 있고, 이를 조절하면 만성적으로 유지되는 신경병증성 통증을 중재할 수 있을 것으로 보인다.

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초록/요약

N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) is known to be involved in central sensitization, which has a similar mechanism with long term potentiation (LTP) in research field. Symptoms of neuropathic pain following peripheral nerve injury are reduced by the NMDA receptor antagonist in humans and rodents, but it causes intolerable side effects that prevent it from being used as an analgesic drug because NMDAR is generally located in the central nervous system (CNS). N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B (NR2B), one of the NMDAR subunits, is more restrictively located than N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1 (NR1), in the CNS such as superficial lamina of the spinal cord, forebrain, and so on. In addition, NR2B has various phosphorylation sites in the c-terminal and interact with postsynaptic density protein-95 (PSD-95), which is a scaffold protein located in the postsynaptic density. Therefore, this study was performed to find out the role of NR2B in the development and/or maintenance of neuropathic pain and NR2B mediated signaling pathway, which interacts with PSD-95 in neuropathic pain after peripheral nerve injury. Sprague-Dawley (Crl: CD, 180-200 gram) rats were used in this study. Left side of L5 spinal nerve was tightly ligated with 6-0 silk under isoflurane anesthesia in the rat (spinal nerve ligation model, SNL). Quadrants of L4 and L5 spinal cord were obtained from SNL operated rats and normal rats. The temporal expression of NR2B, NR2B Tyr1472, NR2B Ser1303, Ca++-calmodulin dependent complex II (CaMKII), Thr286 CaMKII, protein kinase C (PKC) and PSD-95 were quantified after SNL by western blotting. To evaluate the analgesic efficacy of RO 25-6981, NR2B antagonists, autocamtide-2 related inhibitory peptide (AIP), CaMKII inhibitor or chelerythrine (CHE), PKC inhibitor, were intrathecally injected in the early phase (1-4 days after SNL) and in the late phase (7-14 days after SNL) after nerve injury. Paw withdrawal thresholds were assessed with series of von Frey filaments before and after drug injection. Co-immunoprecipitation (Co-ip) was performed to analyze the temporal change of the interaction between Ser1303 and CaMKII, and Ser1303 and PKC, and to evaluate the interaction between Ser1303 and PSD-95 after inhibition of CaMKII, PKC or NR2B. NR2B and Thr286 CaMKII expression were more increased in the early phase than in the late phase at L5 spinal segment. Moreover, NR2B or CaMKII antagonists also elevated paw withdrawal threshold more efficiently in the early phase than in the late phase. Phosphorylation of Ser1303 was increased and maintained from the early phase until the late phase after spinal nerve ligation but Tyr1472, total CaMKII and PSD-95 were not increased. PKC expression was increased in the late phase and paw withdrawal threshold was also efficiently elevated by PKC antagonist in the late phase, but it had little side effects such as sluggish movement. Interaction between Ser1303 and PSD-95 was increased and maintained from the early phase until the late phase. Interaction between Ser1303 and CaMKII was increased in the early phase, and Ser1303 and PKC interaction was existed in the late phase. Above all, AIP and Ro 25-6981 reduced the interaction between Ser1303 and PSD-95, but CHE did not. Thus, it is suggested that NR2B mediated signal transduction pathway may be a possible connector from the development phase to the maintenance phase of neuropathic pain.

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목차

Abstract i

Abstract in Korean iv

List of figure and table viii

Hypothesis and Experimental plans x

Chapter I The validation to see if NR2B is involved in neuropathic pain.

Introduction 1
Result I 6
Discussion 9

Chapter II Role of interaction between Ser1303 and
Ser/Thr kinses on post synaptic density-95

Introduction 19
Result II 24
Result III 28
Discussion 30

Conclusion 45

Materials and Methods 46

References 55

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