Characterization of Acyl Carrier Protein IacP in Salmonella enterica serovar Typhimurium
- 주제(키워드) Salmonella , Acyl Carrier Protein , IacP
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 박용근
- 발행년도 2013
- 학위수여년월 2013. 2
- 학위구분 박사
- 학과 일반대학원 생명공학과
- 세부전공 의약생명공학전공
- 원문페이지 171 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000038731
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045745994
초록/요약
Gram-negative bacteria including S. Typhimurium exploit type III secretion systems through which virulence proteins are delivered into host cytoplasm to reinforce invasive and replicative niche in their host. In this study, I found that an acyl carrier protein IacP encoded by Salmonella pathogenicity island-1 was important for non-phagocytic cell invasion and further for bacterial virulence. Impaired invasion phenotype and retarded rearrangement of actin fibers were seen in the iacP mutant-infected INT-407 epithelial cells, since the translocation and membrane localization of SopB were significantly decreased. Subsequent experiments demonstrated that mice group infected with the iacP mutant exhibited alleviated pathological signs in the intestine and they survived longer than the wild-type infected mice. In addition, I found that in the iacP mutant strain, the orientation of the invertible H segment is in the FljB-expressing phase. Electron microscopy observations indicated that the iacP mutant strain had more flagella per cell than the wild-type strain. The dual productions of FliC and FljB in the iacP mutant strain are processed to induce more immune responses in host cells infected with the iacP mutant strain and contribute to the attenuation of virulence. Overexpression of flagella by expressing two flagellins in the iacP mutant strain enhance the induction of antigen-specific immune responses, which suggests that flagellin FljB would serve as an efficacious adjuvant inducing protective immune responses. Taken together, IacP plays a key role in virulence and metabolism in pathogenic adaptation of S. Typhimurium during transition from the extracellular to the intracellular environmen
more초록/요약
그람 음성 세균인 살모넬라는 type III secretion system (T3SS)을 이용하여 숙주 세포질로 독성 단백질을 분비하여 침입을 강화하고, 숙주 세포 안에서 복제를 한다. 많은 세포질의 단백질 중에서 T3SS에서 분비되는 많은 effector 단백질과 막결합 구조 단백질의 특성과 기능에 관하여 아직 알려지지 않은 것들이 많이 남아있다. 이 논문에서는 Salmonella pathogenicity island-1 (SPI-1)에 의해 암호화되는 아직 정확한 기능이 알려져 있지 않은 IacP에 관하여 연구하였다. 그 결과, 아실 캐리어 단백질인 IacP는 살모넬라의 세포질에 위치하며, 박테리아 독성과 nonphagocytic 세포 침입에 주요하게 작용하였다. 그리고 살모넬라 여러 균주에서도 상피세포 안으로 침입하는데 야생형 균주에 비하여 특이적으로 감소하였으며, iacP 변이 유전자에서 액틴 섬유 (actin fibers)의 재배열이 정상적으로 나타나지 않았다. IacP는 type III translocon 단백질의 분비에는 영향이 없었으나, effector 단백질인 SopB, SopA, 그리고 SopD의 분비는 조절하였다. iacP 변이 균주를 감염시킨 마우스는 야생형 마우스보다 생존률이 높았으며, 장 조직의 병리학적 특징을 관찰한 결과 야생형에 비해 조직의 손상 정도가 적은 것을 확인하였다. 이와 같이 IacP는 T3SS effector 단백질의 전이를 조절하여 살모넬라 독성에 중요한 역할을 한다. IacP 단백질에 의해 조절되는 또 다른 단백질을 찾기 위해 분비된 단백질을 LC/MS 분석을 통하여 iacP 변이 균주에서 박테리아의 편모를 구성하는 편모소 (flagellin) 단백질중의 하나인 fljB 유전자가 특이적으로 많이 발현되는 것을 확인하였다. 편모는 숙주 세포의 침입과 박테리아 운동성에 중요하게 작용하는 표면 기구의 일종이다. 살모넬라는 FliC와 FljB의 두 가지 편모소 (flagellin)가 편모 상변이란 a site-specific DNA inversion 기전에 의해 양자택일적으로 발현된다. 이런 변이 기전은 두 개의 편모소 (flagellin) 발현을 조절하는 중요한 인자로써 분자적인 측면에서 연구가 중요하나, 아직 정확하게 알려진 것은 없다. 본 논문에서는 IacP가 SPI1-inducing 조건에서 살모넬라에서 편모 상변이에 영향을 나타낸다는 것을 발견하였다. 그 실험결과로서, iacP 변이 균주에서 FljB의 전사와 발현이 증가하는 것을 확인하였으나, FliC는 변함이 없었다. 그리고 iacP 변이 균주에서 FljB의 생성은 Hin DNA invertase에 의해 결정된다. 또한, 전자 현미경 관찰에서 iacP 변이 균주가 하나의 박테리아에서 야생형 균주보다 더 많은 편모를 가지고 있었다. 이 결과, IacP는 편모 상 전환과 연관되어 중요한 역할을 한다고 할 수 있다. 최근의 연구에서는 편모를 많이 가지거나, 두 가지 종류의 편모소 (flagellin) FliC와 FljB를 동시에 발현하는 균주는 높은 면역 반응에 의하여 약독화 될 수 있다고 한다. 운동성을 가진 많은 박테리아에서 편모소 (flagellin)는 숙주 세포의 NF-κB 활성과 염증성의 사이토카인의 분비에 기여한다. 즉, 편모소 (flagellin)는 박테리아 백신 후보의 개발을 위한 타겟으로 특히 매력적이라 할 수 있다. FliC와 FljB 편모소 (flagellin)를 모두 발현하는 iacP 변이 균주에서 NF-κB 활성과 연관된 유전자 발현이 증가하였다. 숙주 세포의 침입에 영향이 있는 IacP를 대신하여 기존의 약독화 균주인 BRD509를 이용하여 FljB와 FliC가 동시에 발현하는 새로운 균주를 제작하여 동물 실험을 한 결과, 살모넬라의 특정 LPS와 편모소 (flagellin)에 대한 IgG의 면역 반응이 증가함과 동시에 생존력도 증가하였다. 따라서 iacP 변이 균주에서 FljB와 FliC 두 가지 발현에 의해 증가한 편모에 의해 숙주 세포에서 더 많은 면역 반응을 유도하며, 이는 살모넬라 독성의 약독화에 기여한다고 할 수 있다. 결론적으로, IacP는 세포내의 환경에서 살모넬라 병원균이 세포외부로 분비하는데 있어 독성과 대사에 중요한 역할을 하는 단백질이다.
more목차
CONTENTS
List of Tables i
List of Figures iv
General Abstract v
CHAPTER I. Role of Salmonella Pathogenicity Island 1 Protein IacP in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Pathogenesis
ABSTRACT 2
INTRODUCTION 5
MATERIALS AND METHODS
1. Bacterial strains and growth conditions 6
2. Amino acid sequence analysis and structure prediction 6
3. Construction of Salmonella serovar Typhimurium strains 7
4. Construction of recombinant plasmids 8
5. Preparation of membrane and secreted proteins of Salmonella serovar Typhimurium 9
6. Isolation and silver staining of Salmonella serovar Typhimurium LPS 9
7. Invasion assays 10
8. Translocation assay 10
9. Subcellular fraction and total proteins in infected INT-407 cells 11
10. Western blotting and antibodies 12
11. Immunofluorescence study 13
12. In vivo virulence assays 14
13. Statistical analysis 15
RESULTS
1. S. Typhimurium IacP protein is structurally similar to the E. coli Acp 19
2. IacP is required for the invasion of nonphagocytic cells 24
3. IacP is not necessary for LPS biosynthesis in Salmonella serovar Typhimurium 28
4. IacP did not influence the secretion of SipB, SipC, SipD, SipA, and SptP 30
5. Levels of secretion of SopB, SopA, and SopD were decreased in the iacP mutant 35
6. IacP is important for Salmonella serovar Typhimurium virulence 40
DISCUSSION 50
REFERENCES 56
CHAPTER II. Effect of iacP Mutation on Flagellar Phase Variation in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Strain UK-1
ABSTRACT 58
INTRODUCTION 60
MATERIALS AND METHODS
1. Bacterial strains and growth conditions 61
2. Construction of S. Typhimurium mutant strains 62
3. Plasmid construction 63
4. Preparation of secreted proteins and whole-cell lysates for SDS-PAG 63
5. LC-MS analysis of secreted proteins 64
6. Immunoblotting 65
7. RNA isolation and Northern blot analysis 65
8. Reverse transcription-PCR (RT-PCR) and qPCR analysis 66
9. Microarray analysis 67
10. Determination of frequency of flagellar phase variation 68
11. Determination of phase-on/off orientation 68
12. TEM (Transmission Electron Microscopy) 69
13. Motility assay 69
14. Statistical analysis 69
15. Microarray data accession number 69
RESULTS
1. Identification of secreted protein in the iacP mutant strain 72
2. FljB repression by an acyl carrier function of IacP 76
3. Transcriptional activation of the fljB-fljA operon in the iacP mutant strain 81
4. Inversion of H orientation in the iacP mutant strain under SPI1-inducing conditions 86
5. Inhibition of FliC expression by the plasmid-encoded FljA protein in the iacP mutant strain 90
6. Flagellar biosynthesis in the iacP mutant strain 92
DISCUSSION 99
REFERENCES 103
CHAPTER III. Flagellin FljB Produced in Salmonella enterica Serovar Typhimurium iacP Mutant Strain Enhances Host Immune Responses as a Potent Adjuvant for Oral Immunization
ABSTRACT 105
INTRODUCTION 108
MATERIALS AND METHODS
1. Bacterial strains and growth conditions 109
2. Construction of S. Typhimurium mutant strains 110
3. Construction of recombinant plasmids 111
4. Preparation of secreted proteins and whole-cell lysates of S. Typhimurium 111
5. Western immunoblotting and antibodies 112
6. lmmunogold labelling and transmission electron microscopy (TEM) 113
7. Flagellum staining 113
8. Isolation of cytosolic and nuclear fractions 114
9. Detection of p65 nuclear translocation 115
10. Isolation of Bone Marrow Derived Macrophage (BMDM) 116
11. RNA isolation and Reverse transcription-PCR (RT-PCR) and quantitative real-time PCR (qPCR) analysis 117
12. Invasion assays 117
13. Immunization, sample collection and challenge experiment 118
14. Immune response measurements 119
15. Statistical analysis 119
RESULTS
1. Visual confirmation action of the iacP mutant strain expressing two different flagellar antigen specificities FliC and FljB 123
2. Activation of NF-κB in bone marrow derived macrophage (BMDM) and RAW 264.7 cells infected with the iacP mutant strain 130
3. Induction of proinflammatory cytokines by the iacP mutant strain in macrophage cells 136
4. Construction and characterization of attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium strain expressing flagellin phase 2 FljB 140
5. Protection against wild-type Salmonella challenge and Immune responses to LPS and flagellin in mice orally immunized with attenuated Salmonella expressing FljB and FliC 144
DISCUSSION 150
REFERENCES 154
ABSTRACT IN KOREAN 156
