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식중독균 살모넬라 종 신속 탐지 효소면역바이오센서 개발

ELISA-on-a-chip Biosensor for Rapid Detection of Food-contaminating Salmonella Species

  • 김혜진 (金慧眞, 대학원 바이오마이크로시스템기술협동과정 바이오마이크로시스템기술전공)

초록/요약

Salmonella는 장티푸스와 콜레라와 같은 식품 매개성 질병을 일으키는 장내세균과에 속하는 그람 음성 간균으로 대표적인 식품 오염 균의 하나이다. 이런 이유로, 식품 오염 균을 진단하기 위하여 전통적 배양이나 유전적 증폭, 면역 반응 등을 기반으로 하여 많은 분석 방법이 개발되어져 왔다. 그러나 이런 방법들을 수행함에 있어서 전문 인력이 필요하거나 고가의 실험 장비가 필요한 한계점이 있었다. 또한, 실험 결과에 있어서 민감성과 특이성의 부족 및 Salmonella 균 동정을 위해 수일간의 장시간이 필요하다는 단점이 있었다. 본 연구에서는 이러한 단점들을 보완하기 위하여 면역 크로마토그래피 방법을 이용하여 그 신속함의 장점을 취하고, ELISA 기법의 원리를 이용하여 민감성을 극대화 할 수 있는 효소면역바이오센서 기본으로 한 신속 정확한 특이 진단을 위한 고감도 효소면역바이오센서를 개발하고자 하였다. 고감도 효소면역바이오센서의 적용될 항체 선별의 과정에서 상업적으로 판매되고 있는 항체들의 Salmonella 종 전체에 대한 저감도 민감성과 교차반응성의 문제로 인하여 새로운 특이 고감도 항체의 생산 및 정제 과정을 수행하였다. 다양한 serogroup에 대한 고감도 항체 생산을 위하여 면역원과 면역친화정제 물질로 다른 serogroup들과 항체 공통 인지 부위를 가장 많이 지니는 serogroup B를 이용하였다. 특이 항체의 선별은 교차반응이 우려되는 타 식중독균들과 Salmonella 항혈청을 정제 전에 흡착 반응 후 제거하는 방법을 이용하였다. 전흡착 반응 후 타 식중독균과의 교차반응성이 현저히 감소하였고 전흡착 처리된 항혈청을 Salmonella serogroup B의 LPS를 반응기로 제작한 면역친화컬럼을 통과시켜 고감도 특이 항체를 선별하였다. 정제된 고감도 특이 항체 조합은 신속한 결과 도출과 민감도의 향상을 위하여 현장에서 간편하게 사용할 수 있도록 면역크로마토그래피법을 이용한 플라스틱 키트의 효소면역바이오센서에 적용하였다. 구축된 효소면역바이오센서의 성능 평가를 위하여 각 serogroup 대표 균주들에 대하여 민감성 테스트를 실시한 결과 Salmonella typhimurium (serogroup B)은 5x103 cells/mL, Salmonella enteritidis (serogroup D)는 1x105 cells/mL, Salmonella paratyphi A (serogroup A)는 5x104 cells/mL, Salmonella choleraesuis (serogroup C1)는 5x105 cells/mL의 측정 민감도를 나타냈다. 다양한 serogroup에 대한 민감성 향상은 한국 식품의약품안전청에서 발표한 자료를 기준으로 할 때 지난 5년간 Salmonella 종을 원인으로 발병된 식중독 건수의 약 80%까지 진단 가능하였다. 또한, 효소면역바이오센서는 상업적으로 판매되고 있는 면역크로마토그래피법을 이용한 Salmonella 키트와의 민감도 비교 평가에서 최소 50배 높은 우수한 성능을 나타냈다. 교차반응성에 대한 테스트로 Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli의 1x108 cells/mL 고농도에서 아무런 교차반응이 없음을 확인하였다. 식품공전에 따라 Salmonella typhimurium 10 CFUs/mL을 일상생활에서 흔하게 접할 수 있는 생선 근육이라는 실제 식품 시료에 접종한 후 실시간 배양하여 효소면역바이오센서로 탐지해 본 결과 5시간 이내에 특이 탐지 가능하였다. 동일 실험에서 10 시간 이후에 탐지 가능했던 상업적으로 판매되고 있는 타사의 3종의 키트들에 비교하면 50% 이상 배양시간을 단축한 결과였다. 이러한 결과는 고농도의 타 식중독 균과의 교차반응이 없는 고감도 효소면역바이오센서의 개발로 전배양 과정을 생략할 수 있는 시간의 단축 효과에 기인한다. 한국 식품의약품안전청의 발표에 의하면 지난 5년간 식중독의 발생 건수의 44%가 원인 불분명이며 이 원인균 중에는 타 식중독 균 뿐 아니라 자연독이나 바이러스에 의한 발병도 매해마다 2배가량 증가하고 있다고 한다. 면역 크로마토그래피 방법을 이용하여 그 신속함의 장점을 취하고 ELISA 기법의 원리를 이용하여 민감성을 극대화 할 수 있는 효소면역바이오센서는 이러한 자연독, 바이러스 그리고 타 식중독 균 등에 대해 누구나 쉽게 신속 정확한 진단 키트의 개발의 길로도 이어질 것이다.

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목차

ABSTRACT I
요 약 III
LIST OF TABLES X
LIST OF FIGURES XI
ABBREVIATIONS XV

제 1 장 연구 배경 및 논문 개요 1

1.1 연구 배경 1
1.2 살모넬라증의 병리 2
1.3 Salmonella 진단 연구 동향 2
1.4 연구 방향 및 목적 4
1.5 논문의 구성 4
1.6 참고문헌 6


제 2 장 Salmonella 항체 생산과 정제 및 특성화 9

2.1 서론 9
2.2 재료 및 방법 11
2.2.1 실험 재료 11
2.2.2 실험 재료 준비 12
2.2.2.1 배지 제조 12
2.2.2.2 균주의 보관 12
2.2.2.3 균주의 배양 13
2.2.2.4 균주 수거 및 농도 측정 13
2.2.2.5 항혈청 생산을 위한 항원 준비 14
2.2.2.6 Salmonella serogroup B의 항혈청 정제를 위한
면역친화컬럼 제조 14
2.2.3 Salmonella serogroup B 항혈청의 전흡착법 15
2.2.4 Salmonella serogroup B 항혈청의 항체 정제 15
2.2.5 Salmonella serogroup B 항혈청의 항체 정제 분획액에 대한
Bradford 및 ELISA assay 16
2.2.6 Salmonella serogroup B 항체의 농축 및 정량 17
2.2.7 Salmonella serogroup B 항체의 특성화 18
2.2.8 Salmonella serogroup C1 항혈청의 정제 및 특성화 18
2.2.8.1 항혈청의 반응성 확인 18
2.2.8.2 항체의 정제 및 특성화 19
2.3 결과 및 토의 19
2.3.1 Salmonella serogroup B 항혈청의 생산과 전흡착법 19
2.3.2 Salmonella serogroup B 항체의 정제 21
2.3.3 Salmonella serogroup B 항체의 농축 및 정량 22
2.3.4 Salmonella serogroup B 정제 항체의 특성화 22
2.3.5 Salmonella serogroup C1 항혈청의 정제 및 특성화 23
2.4 결론 24
2.5 참고문헌 26


제 3 장 Salmonella 종 탐지용 효소면역바이오센서 제작 28

3.1 서론 28
3.2 재료 및 방법 31
3.2.1 실험 재료 31
3.2.2 Salmonella serogroup A, B, D 센서 개발 방법 32
3.2.2.1 Salmonella serogroup B 항체와 HRP의 중합 32
3.2.2.2 Salmonella serogroup B 항체-HRP 중합체의 특성화 32
3.2.2.3 Salmonella serogroup B 항체의 상업적 판매되고
있는 항체와의 Sandwich ELISA 활성도 비교 33
3.2.2.4 Salmonella serogroup B 항체의 Sandwich ELISA를
통한 타 식중독균에 대한 교차반응성 34
3.2.2.5 Salmonella serogroup B 항체의 상업적 판매되고
있는 항체와의 Immunochromatography 민감도 비교 34
3.2.2.5.1 신호발생패드의 제조 34
3.2.2.5.2 중합체패드의 제조 35
3.2.2.5.3 면역스트립 제조와 조립 35
3.2.2.5.4 Salmonella serogroup B 항체의 상업적 판매되고
있는 항체와의 Immunochromatography 민감도 비교 36
3.2.2.6 효소면역바이오센서의 제조 37
3.2.2.6.1 신호발생패드의 제조 37
3.2.2.6.2 중합체 패드 제조 37
3.2.2.6.3 면역스트립 제조와 조립 37
3.2.2.7 Salmonella Serogroup A, B, D 탐지 효소면역바이오센서
성능 평가 38
3.2.2.7.1 Salmonella serogroup A, B, D에 대한 민감도 38
3.2.2.7.2 Salmonella serogroup A, B, D 탐지 센서의
교차 반응도 38
3.2.2.7.3 상업적 판매 키트와의 Salmonella serogroup B에
대한 민감도 비교 38
3.2.2.7.4 상업적 판매 키트와의 Salmonella serogroup B의
실시간 배양에 따른 탐지 최소 시간 비교 39
3.2.2.7.4.1 접중 균주들의 준비 및 개수 39
3.2.2.7.4.2 배양 및 시간 별 효소면역바이오센서 탐지 39
3.2.2.7.5 식품시료를 이용한 Salmonella serogroup B의
실시간 배양에 따른 탐지 최소 시간 비교 40
3.2.2.7.5.1 접중 균주들의 준비 및 개수 40
3.2.2.7.5.2 식품 시료의 준비 40
3.2.2.7.5.3 배양 및 시간 별 효소면역바이오센서 탐지 40
3.2.3 Salmonella serogroup C1 센서 개발 방법 41
3.2.3.1 Salmonella serogroup C1 항체와 HRP의 중합 41
3.2.3.2 Salmonella serogroup C1 항체-HRP 중합체의 특성화 41
3.2.3.3 Salmonella serogroup C1 항체의 Sandwich ELISA 42
3.2.3.4 상업적 판매 키트와의 Salmonella serogroup C1에
대한 민감도 비교 42
3.3 결과 및 토의 43
3.3.1 Salmonella serogroup B 항체-HRP 중합체의 특성화 43
3.3.2 Salmonella serogroup B 항체의 상업적 판매되고 있는
항체와의 Sandwich ELISA 활성도 비교 44
3.3.3 Salmonella serogroup B 항체의 Sandwich ELISA를 통한
타 식중독균에 대한 교차반응성 45
3.3.4 Salmonella serogroup B 항체의 상업적 판매되고 있는
항체와의 Immunochromatography 민감도 비교 46
3.3.5 Salmonella serogroup A, B, D에 대한 민감도 47
3.3.6 Salmonella serogroup A, B, D 탐지 센서의 교차 반응도 48
3.3.7 상업적 판매 키트와의 Salmonella serogroup B에 대한
민감도 비교 49
3.3.8 상업적 판매 키트와의 Salmonella serogroup D에 대한
민감도 비교 50
3.3.9 상업적 판매 키트와의 Salmonella serogroup B의 실시간
배양에 따른 탐지 최소 시간 비교 51
3.3.10 식품시료를 이용한 Salmonella serogroup B의 실시간
배양에 따른 탐지 최소 시간 비교 52
3.3.11 Salmonella serogroup C1 항체 HRP 중합체의 특성화 53
3.3.12 Salmonella serogroup C1 항체의 Sandwich ELISA를
통한 친화성 평가 54
3.3.13 Salmonella serogroup C1 항체의 Sandwich ELISA를
통한 타 식중독균에 대한 교차반응성 55
3.3.14 Salmonella serogroup C1에 대한 민감도 및 타 식중독
균에 대한 교차반응성 56
3.3.15 상업적 판매 키트와의 Salmonella serogroup C1에
대한 민감도 비교 57
3.4 결론 57
3.5 참고문헌 59


제 4 장 결론 및 전망 60

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