Mechanisms of MET Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI)-induced apoptosis in non-small cell lung cancer (NSCLC)
비소세포폐암에서 MET Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI)에 의한 세포사멸 기전에 대한 연구
- 주제(키워드) Met receptor , non-small cell lung cancer , p53 , apoptosis
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 김 열 홍
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 2
- 학위구분 박사
- 학과 일반대학원 의학과
- 세부전공 의생명
- 원문페이지 114 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000021566
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045579454
초록/요약
Recent advances in molecular understanding of pathogenesis of non-small cell lung cancer (NSCLC) at molecular level improved treatment outcome. However, the overall 5-year survival rate of individuals with lung cancer remains at less than 15%. Therefore novel therapeutic strategies are needed to improve the survival rate of patients with lung cancer. MET, the tyrosine kinase receptor for hepatocyte growth factor (HGF), is involved in mediating tumorigenesis, cell migration, invasion and metastasis, and is frequently deregulated in various human cancers including NSCLC. The MET receptor is an attractive potential target for novel therapeutic inhibition in human cancer. Recently, the MET tyrosine kinase inhibitors (MET TKIs), such as PHA-665752 and SU11274, have most extensively been evaluated in preclinical model, and have been known to be effective in growth inhibition of various malignancies. However, the mechanisms of MET TKIs on growth-inhibitory effect are not clear. p53, tumor suppressor gene, is a potent regulator of apoptosis which is induced by DNA damage. The deregulation of p53 protein is related to cancer development and drug resistance. Furthermore loss of p53 wild-type function accelerates Met-induced oncogenesis. The purpose of this study is to investigate the mechanisms of growth inhibitory of SU11274, MET TKI, and role of p53 in the pathway of MET TKI-induced apoptosis. p53 wild-type A549 cells and p53 null-type Calu-1 cells, which have no MET gene amplification or mutation were used, SU11274 had more profound growth inhibitory effect in A549 cells than Calu-1 cells. Also, SU11274 significantly induced apoptosis in A549 cells which have wild-type p53, compared with Calu-1 cells. SU11274 increased the expression of p53 protein through the modulation of p53 transitional level. Accumulated p53 protein after SU11274 treatment induced up-regulation of Bax, PUMA expression and down-regulation of Bcl-2 expression, subsequently activating caspase 3 in A549 cells. Furthermore, Inhibition of p53 expression in A549 cells using siRNA technology caused significant decrease of apoptosis by SU11274, down-regulation of PUMA and Bax proteins, and up-regulation of Bcl-2 protein. The introduction of p53 into Calu-1 led effectively to SU11274-induced apoptosis through p53-mediated pathway. In A549 xenograft model, SU11274 effectively shrunk tumor volume and also induced apoptosis via increases of p53 protein. In conclusion, SU11274 significantly induced apoptosis in NSCLC with wild-type p53 through the accumulation of p53 protein. p53 plays an important role in SU11274-induced apoptosis, and that p53 status seems to be related with determining the sensitivity of SU11274 in NSCLC. Combination of genetic therapy by restoring p53 and SU11274 would be attempted in the future for improving survival rates in NSCLC patients.
more초록/요약
폐암은 전세계적으로 발생률과 사망률에서 우위를 차지하는 암이다. 현재까지 폐암의 치료에 방사선치료요법과 항암요법이 사용되고 있지만, 폐암 환자의 5년 이상 생존율은 15% 이내로 낮다. 따라서 폐암 환자의 생존율을 향상시키기 위한 새로운 치료 전략이 필요하다. 지난 10년 동안 분자적 기술의 발달과 더불어 폐암 발생 기전에 대한 활발한 연구로 인해 폐암과 관련된 세포 성장 신호전달 체계가 규명되었고 최근 이들을 표적으로 하는 표적치료제가 개발되고 있다. 폐암 치료에 있어서 epidermal growth factor receptor (EGFR)를 표적으로 하는 gefitinib와 erlotinib 그리고 vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)를 표적으로 하는 bevacizumab 등이 사용되고 있지만 이들의 치료 반응은 일부 환자에 국한되어 있으며, 초기에 반응을 보이던 환자들도 지속적으로 투여하였을 때 약제 내성이 나타난다. 따라서 치료가 지속적으로 유지되면서 내성이 적게 유발되는 새로운 표적 치료제의 도입이 시급하다. MET은 hepatocyte growth factor (HGF)를 위한 tyrosine kinase receptor로써 세포 증식, 세포 이동, 그리고 전이 등에 관여하며, MET의 비정상적인 활성은 암 발생에 주요한 요인이 된다. 현재 MET 신호 전달 체계를 억제시키기 위한 다양한 방법의 약제가 개발되거나 임상실험 단계에 있다. 특히, 전임상 모델에서 PHA-665752와 SU11274와 같은 MET tyrosine kinase inhibitors (TKIs)의 항암효과에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 이들 MET TKIs의 항암 효과가 폐암, 위암 등과 같은 다양한 암세포주와 동물 모델에서 나타나고 있으나 항암 기전에 대한 연구는 미미하다. p53은 암 억제 유전자로써 DNA 손상에 의한 세포 사멸에 중요한 작용을 한다. p53유전자 변이나 손실로 인해 정상 기능의 상실은 암의 발달이나 약제 내성을 유도한다. 또한 p53의 상실은 MET에 의한 암 발생을 촉진시킨다. 본 연구에서는 비소세포폐암 세포주와 동물 모델에서 MET TKI의 일종인 SU11274의 항암작용에 p53이 중요한 조절 인자로써 기능하는지에 대한 연구를 수행하였다. 연구를 위해서 wild-type MET을 가지면서 p53의 status가 다른 비소세포폐암 세포주인 A549 (p53 wild-type) 과 Calu-1 (p53 null-type)를 사용하였다. SU11274를 처리하였을 때 p53이 없는 Calu-1 세포 주에 비해 wild-type을 가진 A549 세포 주에서 성장 억제와 세포 사멸이 효과적으로 나타났다. 또한 SU11274는 p53 단백질의 번역 단계 (translational level)에 작용하여 p53의 발현을 증가시켰다. SU11274에 의해 증가된 p53 단백질은 pro-apoptotic protein인 PUMA, Bax와 anti-apoptotic protein인 Bcl-2의 조절을 통해 궁극적으로 caspase 3를 활성화 시켜 세포 사멸을 유도하였다. 또한 p53 siRNA를 이용하여 p53의 발현을 억제하였을 때 SU11274에 의한 세포 사멸이 일어나지 않았으며, p53이 없는 세포주에 p53을 도입하였을 때 SU11274에 의한 세포 사멸이 유도되었다. A549 xenograft 동물 모델에서 SU11274를 처리하였을 때도 p53 단백질의 발현을 증가시켜 세포 사멸을 효과적으로 유도하였다. 결론적으로 SU11274는 wild-type을 가진 비소세포폐암에서 p53 단백질의 증가를 통해 세포 사멸을 유도함을 세포주와 동물 모델에서 확인하였다. 본 연구에서는 p53이 비소세포 폐암에서 SU11274의 민감도를 예측할 수 있는 마커로써의 가능성을 확인하였으며, p53의 유전자 치료와 SU11274의 병행처리를 통해 비소세포폐암 환자의 생존율 향상이 기대 된다.
more목차
ABSTRACT ⅰ
CONTENTS ⅴ
LIST OF FIGURES ⅸ
I. INTRODUCTION 1
1. Lung cancer and Treatment 1
2. MET (mesenchymal-epithelial transition factor) 3
2-1. MET 3
2-2. MET tyrosine kinase inhibitors (MET TKIs) 5
3. p53 6
4. Relation between MET/PI3K signaling and p53 8
5. Purpose of this study 10
II. MATERIALS AND METHOES 12
1. Cell culture and chemicals 12
2. Cell proliferation assay 13
3. Colony forming assay 13
4. Cell cycle analysis and apoptosis analysis 14
5. Western blot analysis 14
6. Immunofluorescence staining 16
7. Plasmid construction and gene transfection 16
8. siRNA technology 18
9. In vivo study 18
10. Ex vivo analysis of tumor material 19
11. Statistical analysis 20
III. RESULTS 22
1. SU11274 significantly suppressed cell proliferation in A549 cells, compared with Calu-1 cells 22
2. SU11274 effectively induced apoptosis in A549 cells 24
3. SU11274 accumulated p53 protein through translational modulation in apoptosis-induced A549 cells 25
4. Accumulated p53 protein by SU11274 induced apoptosis through the regulation of Bax, PUMA and Bcl-2 in A549 cells 26
5. Blocking of p53 expression by p53 siRNA suppressed apoptosis in A549 cells 27
6. Exogenous p53 induced apoptosis through p53-mediated pathway in Calu-1 cells 28
7. SU11274 induced apoptosis through the accumulation of p53 protein in vivo 30
IV. DISCCUSION 32
V. CONCLSIONS 38
VI. FIGURES 39
VII. FIGURES LEGENDS 68
VIII. REFERENCE 82
KOREAN ABSTRACT 93
ACKNOWLEDGEMENT 97
List of Figures
Figure. 1 Effects of SU11274 on growth inhibition in A549 and Calu-1 cells 39
Figure. 2 Effects of SU11274 on MET pathway in A549 and Calu-1 cells 43
Figure. 3 Effects of SU11274 on cell cycle or apoptosis in A549 and Calu-1 cells 44
Figure. 4 Effects of SU11274 on the level of p53 protein in A549 cells 47
Figure. 5 Effects of SU11274 on the transitional level of p53 protein in A549 cells 49
Figure. 6 Effects of increased p53 protein by SU11274 on apoptosis in A549 cells 51
Figure. 7 Effects of p53 siRNA on apoptosis in SU11274-treated A549 cells 53
Figure. 8 Effects of exogenous p53 on apoptosis in SU11274-treated Calu-1 cells 56
Figure. 9 Effects of SU11274 on tumor growth in A549 xenograft model 60
