Site-Specific Integration in Human Cell by Phage ΦFC1 Integrase MJ1
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 발행년도 2004
- 학위명 박사
- 학과 대학원:생명공학과
- 식별자(기타) DL:000014914308
- 서지제어번호 000045213085
초록/요약
이전 연구에서, bacteriophage ΦFC1이 Enterococcus faecalis KBL703에서 UV induction을 통해 분리 동정되었으며 이는 temperate phage의 한 종류인 것이 보고되었다. 이 phage는 phage attachment site인 attP와 bacterial attachment site인 attB사이에서 site-specific integration을 일으키는 integrase를 가지고 있다는 것을 밝혀냈으며 이를 MJ1이라 명명하였다. 또한 이 MJ1에 의한 attP와 attB사이에서의 site-specific integration이 E.coli에서 다른 factor의 도움 없이 일어남을 알아냈다. 이 연구에서는 이를 바탕으로 MJ1에 의한 site-specific integration이 human cell에서 일어난다는 것을 증명했다. In vivo에서, MJ1에 의한 integration을 보이기 위해 attP와 attB를 가지고 있는 vector를 MJ1 expression vector와 함께 293T cell에 cotransfection 했으며 GFP를 reporter로 사용해 그 activity를 관찰하였다. 293T cell에서 GFP의 발현을 confocal microscopy와 FACS analysis를 통해 알아본 결과, MJ1에 의한 site-specific integration이 다른 accessory protein의 도움 없이 일어난다는 것을 볼 수 있었다. 마찬가지 방법으로, attR과 attL간의 excision을 GFP로 알아본 결과, GFP는 발현하지 않았으며, 이는 MJ1에 의한 excision이 일어나지 않았음을 보여주었다. 또한 MJ1에 의한 site-specific integration이 일어날 수 있는 최소한의 attP와 attB의 size를 알아보기 위해 attP와 attB의 nested deletion을 실행했으며 앞에서와 같은 방법으로 GFP의 발현을 관찰하여 그 activity를 알아보았다. 그 결과, 각각 약 740과 290 bp의 크기를 가졌던 attP와 attB는 그 functional minimal size를 54와 48 bp 정도의 크기로 줄일 수 있었다. 이와 같은 결과로 볼 때, 인간 세포에서 MJ1을 이용한 site-specific integration system의 개발은 gene therapy에 있어서 gene delivery system의 구축에 있어서 좋은 시작이 될 수 있다.
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Table of Contents
Page
List of Tables i
List of Figures ii
List of Abbreviation iii
ABSTRACT iv
I. INTRODUCTION....1
1. Background of this study....1
2. Integrase MJ1 from phage ФFC1 within E.faecali…2
3. Site-specific integration in human cell…4
4. Integration vector system…5
II.MATERIALS AND METHODS…10
1. Cell culture and transfection assay…10
2. Plasmids construction...10
3. Fluorescence Microscopy...15
4. Fluorescent-activated cell sorting (FACS)analysis 16
5. Indirect Immunofluorescent staining cultured cells 16
6. Reverse transcription-PCR (RT-PCR) 17
III. RESULTS...18
1. MJ1 expression in human cell....18
2. Site-specific integration or excision...21
3. Determination of minimal size of attB and attP...24
IV. DISCUSSION.....38
V. REFERENCES....42
VI. ABSTRACT IN KOREAN...49
VII. ACKNOWLEDGEMENT...51
