Conformational changes of RGS5 in response to anionic phospholipids.
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 발행년도 2004
- 학위명 박사
- 학과 대학원:생명공학과
- 식별자(기타) DL:000014914278
- 서지제어번호 000045213500
초록/요약
G 단백질 신호 전달 체계에서 조율하는 RGS 단백질은 GTP분해 효소를 촉매하여 신호 전달을 저해하는 조절 역할을 담당한다. 대부분의 RGS단백질은 Galpha 단백질에 결합하여 GTP분해효소를 충분히 활성화 시킬 수 RGS 도메인과 RGS의 생체내 완전한 기능에 필수적인 역할을 RGS 이외의 부분을 가지고 있다.이 논문에서는 RGS5의 조절작용을 이해하기 위해 RGS5의 구조적인 특징과 생체막의 결합 연관성을 조사하였다. 아미노 말단부분을 제거한 RGS5 (ΔRGS5)의 경우, 생체막의 구성성분인 인지질과 결합하는 능력이 상실된 반면, 아미노 말단부분을 가지고 있는 RGS5의 경우 결합하는 것을 확인할 수 있었다. CD와 NMR spectroscopy를 이용하여 RGS5와 ΔRGS5의 구조를 비교한 결과 RGS5의 아미노 말단부분은 RGS도메인의 구조형성에는 관여하지 않는 것을 알 수 있었다. PA는 RGS5와 높은 상동관계를 유지하고 있는 RGS4의 잠재적인 저해제로 알려져 있는 생체막 구성성분으로써, PA를 통해 RGS5의 저해 기작을 구조적인 측면에서 유추할 수 있었다. 그것은 PA에 의해 RGS5의 RGS도메인 부분에 위치하는 RGS domain의 unfolding을 가져와 결합을 파괴시킴으로써 RGS의 기능을 저해할 수 있다. 이 논문에서는 RGS5의 저해를 구조적인 측면을 조사하였으며, 저해가 Galpha의 결합 부위인 카복실 말단부분에서 일어남을 제안하였다.
more목차
Table of contents~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ⅰ
List of tables~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ⅲ
List of figures~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ⅳ
Astract~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ⅵ
1. Introduction~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1
1.1. G protein coupled receptors and G proteins~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1
1.2. RGS proteins regulate G protein activity~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 2
1.3. Classification of RGS proteins~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 5
1.4. RGS5 protein~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 8
1.5. The membrane binding of RGS proteins.~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 8
1.6 Goals of this study.~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 10
2. Material and Methods~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~11
2.1 Materials~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 11
2.2 Methods~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 12
2.2.1 Bacterial expression construction of His6-RGS5 proteins~~~~~~~~~~~~ 12
2.2.2. Expression and purification of mouse RGS5 proteins~~~~~~~~~~~~~~ 13
2.2.3. Determination of structural domain of recombinant RGS5~~~~~~~~~~ 15
2.2.4. Expression and purification of N-40a.aΔRGS5~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 15
2.2.5. Structural characterization of RGS5 and ΔRGS5~~~~~~~~~~~~~~~~~ 17
2.2.6. Association of RGS5 with anionic phospholipids membranes~~~~~~~~ 18
2.2.7. Conformational change analysis of RGS5 in response to PA liposome~~ 19
2.2.8. Binding assay of RGS5 or RGS5 mixed with PA and Gi3 protein
by ELISA.~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 21
3. Results~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 23
3.1 Expression and Purification of RGS5 proteins~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~23
3.2. Determination of RGS5 structural domain by limited proteolysis~~~~~~~~ 23
3.3. Expression and Purification of ΔRGS5~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 24
3.4. Secondary st
