비침투성 분자의 세포내 전이에 의한 분포 및 기능 분석
- 주제(키워드) 전기전이 , 체세포 , 탈분화 인자 , 항체 , siRNA , iPS 세포
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 이동호
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 8
- 학위명 석사
- 학과 일반대학원 분자세포생물학과
- 세부전공 세포발생학전공
- 원문페이지 56 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000009899
- 본문언어 한국어
- 제출원본 000045551398
초록/요약
비침투성 분자의 세포내 전이에 의한 분포 및 기능 분석 이 동 호 고려대학교 생명공학원 초록 현재의 유사줄기세포 기술은 환자의 체세포를 사용할 수 있기 때문에 면역거부 반응을 피할 수 있으나 재현성, 균일성, 효율성이 낮으며, 유전적 변형을 해야 한다는 데에 그 문제가 있다. 본 연구는 따라서, 유전자 조작을 피하고 새로운 표적 물질을 이용하여 새로운 iPS 세포 기법의 가능성을 검토하고자 하였다. 이를 위해 첫째, 세포내로 분자의 전이기법을 확립하고, 둘째, 이같이 확립, 실시된 기법을 바탕으로 인간 유방상피세포인 MCF10A 세포 및 돼지 귀 섬유아세포를 이용하여 게놈성 및 비게놈성 탈분화 인자 혹은 단백질 산물을 표적으로 그에 대한 각각의 항체 및 siRNA 의 전이전이 기법에 의한 탈분화를 유도하고자 하였다. 전기전이를 이용한 비유전적 전이에 의하여 다양한 크기의 분자, 항체 등을 이용하여 안정된 적정 전기전이의 조건을 확립하였으며, 이 같은 조건하에서 3회 또는 5회의 전기전이를 반복적으로 실시한 결과, 세포배양 및 유지를 할 수 있을 정도의 세포생존 및 전이된 단백질 분자인 항체의 기능적 활성을 보였으며, 전이분자는 세포질뿐만 아니라, 핵 내에까지도 전달되는 것을 보여 주었다. 또한 단순한 전달뿐만 아니라, 기능적으로도 분석한 결과, 줄기세포 마커인 alkaline phosphatase, Nanog, Oct4, Sox2, SSEA-1 또는 SSEA-3 의 발현을 일부 MCF10A 세포와 돼지 귀 섬유아세포에서 발현됨을 확인하였다. 이 같은 결과는 새로운 표적인 epigenetic 상태에 관여하는 주요 유전자를 표적으로 하여 체세포의 탈분화는 항체 및 siRNA 전이에 의하여 가능하며, 보다 개선된, 즉 복합 표적 항체 및 siRNA 전이에 의하여 보다 효율적인 탈분화 유도에 의한 iPS 세포 수립의 가능성을 열어 iPS 세포 연구에 중요한 실험연구 토대를 제공할 수 있을 것이다. (색인어: 전기전이, 체세포, 탈분화 인자, 항체, siRNA, iPS 세포)
more초록/요약
Abstract in English Analysis of Distribution and Functions of Non-permeable Molecules after Intracellular Delivery Dong Ho Lee School of Life Sciences and Biotechnology, Korea University Abstract Although current technology for iPS cells can avoid the use of human oocyte and immune rejection, reproducibility, consistency and efficiency are far below the optimum. In particular, to avoid genetic modification of stem cells, firstly, a reliable intracellular delivery of non-permeable molecules including proteins and siRNAs was established. Secondly, non-genetic dedifferentiation of two somatic cells, human breast epithelial MCF10A cells and pig ear fibroblasts were induced by the intracellular delivery respective antibodies or siRNAs of dedifferentiation factor involved in genomic or non-genomic states as new targets for dedifferentiation. The results demonstrated that various sizes of non-permeable molecules including macromolecules can be delivered into over 90.3~93.4% of cells without rapid cell death caused by electrical shock as shown by FACS, USFP and microscopic analyses, providing enough number of cells to carry out further maintenance of proliferating cells undergoing dedifferentiation. After repeated electric transfers under the established optimum delivery of dedifferentiation factor antibodies or siRNAs of the dedifferentiation factors, the transferred antibodies showed specific binding to the corresponding cytoskeleton proteins within the cytoplasm and the nucleus, indicating that the transferred molecules still have functional properties. After continuous subcultures, portions of somatic cells showed expressions of stem cell markers including alkaline phosphatase, Nanog, Oct4, Sox2 and SSEA-1 or SSEA-3 in either in MCF10A cells and pig ear fibroblasts. Taken these together, the results suggest that new targets involved in dedifferentiation of genomic and non-genomic states may provide important tools for dedifferentiation of somatic cells for the establishment of iPS cells. It was proposed that combination of these dedifferentiation targets under the optimum delivery could open a novel way of making iPS cells. (Key words: electroporation, somatic cell, dedifferentiation, antibody, siRNA and iPS cell)
more목차
1. 서론
1.1 생식세포형성
1.2 다능성 배아세포
1.2.1 배아줄기 세포
1.2.2 배아종양 세포
1.2.3 배아생식 세포
1.3 탈분화 (dedifferentiation)에 대한 연구
1.3.1 전체 세포질에 의한 탈분화
1.3.2 세포융합에 의한 탈분화
1.3.3 다능성 전사인자 전이에 의한 탈분화
1.4 다능성 전사인자
1.4.1 Oct4
1.4.2 Nanog
1.4.3 Sox2
1.4.4 cMyc
1.4.5 Klf4
1.5 세포내의 다양한 분자의 전이 기법
1.5.1 전기전이
1.5.2 DNAs
1.5.3 RNAs
1.5.4 Small interfering RNAs
1.5.5 Peptides
1.6 연구목적
2. 재료 및 방법
2.1 인간 유방상피 MCF10A 및 되지 귀 섬유아세포의 배양 및 유지
2.2 전기전이에 의한 여러가지 분자들의 전이
2.3 전이된 분자의 분석
2.3.1 IgG-FITC
2.3.2 단백질의 정량분석
2.3.3 세포사멸분석
2.3.4 단백질 전이의 기능분석
2.3.4.1 단백질 전이 능력
2.3.4.2 BrdU incorporation
2.4 siRNA 분자의 세포내 전이
2.4.1 MCF10A 와 PEF 세포내로의 전이
2.4.2 Alkaline phosphatase (AP) 염색
2.4.3 immunohistochemistry (IHC) 염색
3. 결과
3.1 전기전이에 의한 MCF10A 세포 내의 전이 능력
3.2 세포에 전이된 단백질의 정량분석
3.3 전기전이된 분자의 세포내 분포
3.4 전기전이 적정조건의 결정
3.5 전기전이 후 세포사멸분석
3.6 세포 골격 항체가 전이된 MCF10A 세포의 증식분석
3.7 MCF10A 세포의 탈분화 유도
3.8 MCF10A 세포의 탈분화 촉진
3.9 돼지 귀 섬유아세포의 탈분화
3.10 feeder 에 의한 MCF10A 세포와 PEF 의 탈분화
4. 고찰
References
국문초록
