Proteomic Analysis of Immune and Parasitism-associated Proteins in Bombyx mori and Plutella xylostella larvae
- 주제(키워드) Parasitism , Plutella xylostella , Cotesia plutellae , innate immunity
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 한성식
- 발행년도 2009
- 제출일 2009-01-09
- 학위수여년월 2009. 2
- 학위명 박사
- 학과 일반대학원 생명공학과
- 세부전공 의약생명공학 전공
- 원문페이지 103 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000008460
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045532908
초록/요약
Insects use their innate immunity to protect themselves from foreign invaders, such as microorganisms, nematodes and insect parasites. An endoparasitoid wasp, Cotesia plutellae, parasitizes the diamondback moth Plutella xylostella, and efficiently suppresses host immune responses. In this study, we investigated differential protein expression patterns in immunized Bombyx mori larvae and parasitized Plutella xylostella larvae (Lepidoptera), to identify immune- and parasitism-associated factors. First, heat-inactivated Bacillus megaterium were injected into B. mori larvae at 4 days after final larval ecdysis. After six hours, we analyzed the hemolymph proteins that were differentially regulated in the immune-challenged larvae using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. After the injection, 41 spots were differentially regulated, and heat shock 70 kDa protein cognate, peptidoglycan recognition protein, anti-chymotrypsin precursor, gloverin-like protein 1~4, and antennal binding protein 7 were newly synthesized in the hemocyte and plasma. To parasitism-associated proteins in P. xylostella were assessed every 48 h after parasitism by C. plutellae. Three hundred fifty protein spots were detected, of which approximately 50 spots were differentially expressed in the parasitized P. xylostella larvae at every 48 h, which included pxSerpin 2, translationally controlled tumor protein (TCTP), signal transduction histidine kinase, apolipophorin-III, and fatty-acid binding protein. PxSerpin 2 and TCTP gene were further analyzed in expression and tissue localization, respectively. Real-time PCR analysis of pxSerpin 2 revealed a poor correlation between the mRNA level and protein abundance. Mitochondria and endoplasmic reticulum were morphologically changed in parasitized P. xylostella hemocytes. Cup-shaped, lysosome-fused mitochondria and endoplasmic reticulum burbling were detected in the parasitized host hemocytes using transmission electron microscopy. TCTP was localized in necrotic hemocytes of P. xylostella. The results suggest that these parasitism-associated proteins may participate in suppression of host immune responses along with morphological changes of hemocyte. Consequently, immune-responsive and parasitism-regulated proteins that investigated in this studies provide useful platform to understand innate immunity of insect Lepidoptera and cast new insights of development for host-specific pest control strategies.
more초록/요약
곤충은 선천성 면역과 후천성 면역으로 이루어진 면역체계를 가진 포유류와는 달리, 선천성 면역만으로도 외부 환경으로부터 자신을 효율적으로 방어한다. 하지만 숙주의 면역체계를 적당히 억제하고 조절하여 성공적으로 parasitism을 확립시켜 숙주의 몸 안에 알을 낳는 기생포식자도 있다. 본 연구는 면역반응을 유도한 누에(Bombyx mori) 유충과 기생 당한 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충을 대상으로 이용하여 곤충의 선천성 면역의 조절과 억제에 관계된 단백질들을 연구하였다. 먼저 열처리한 박테리아를 이용해 면역반응을 유도한 누에유충의 혈액에서 41개의 단백질 발현 패턴이 변화하는 것을 찾아낼 수 있었으며 이중에서 8개의 초기면역반응에 관계하는 단백질을 동정할 수 있었다. Heat shock 70kDa protein cognate (Hsp70), antennal binding protein 7, peptidoglycan recognition protein (PRGP), antichymotrypsin precursor, and gloverin-like protein 1~4 단백질이 혈구와 혈장에서 새롭게 합성되는 단백질임을 알 수 있었다. 또한 내부기생곤충인 프루텔고치벌(Cotesia plutellae)에 의해 면역반응이 억제된 (기생된) 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충으로부터 기생 후 매 48시간마다 혈액을 체취하여 기생 후 유충의 발생단계에 따른 기생특이적 단백질을 조사하였다. 약 50~60개의 단백질들의 발현패턴이 변화하였으며 이 중 26개의 기생 특이적 단백질을 동정하고 기생 후 시기별 단백질 발현양을 조사하였다. 이중에서 translationally controlled tumor protein (TCTP)과, Serine protease inhibitor 2 (pxSerpin 2)가 각각 신호전달 관련 단백질과 면역반응 관련 단백질로 분류되어 추가 분석을 실시하였다. 이 두개의 단백질 서열로부터 primer를 합성하여 각각의 유전자를 클로닝하고 mRNA의 발현양을 조사한 결과 pxSerpin 2의 유전자 발현양의 패턴이 단백질의 발현패턴과 상반된다는 것을 알 수 있었다. 또한 기생당한 숙주의 전체 혈구수가 약 50% 정도 감소하는 것을 THC실험을 통해 알 수 있었다. 이때 기생당한 숙주 혈구의 apoptosis가 대조구보다 약 3배정도 증가한 것을 알 수 있었으며 기생당한 혈구를 투과전자현미경으로 관찰한 결과 핵의 condensation이 일어난 것을 알 수 있었다. 결론적으로 본 연구를 통해 밝혀진 면역과 기생관련 단백질들은 곤충의 선천성 면역을 이해하는 데 도움이 될 것이며, 더 나아가 기주 특이적인 해충방제 기술을 개발하는데 새로운 정보를 제공할 것으로 사료된다.
more목차
Chapter Ⅰ. Proteomic analysis of immunized Bombyx mori larvae hemolymph = 1
Abstract = 2
Introduction = 3
Materials and Methods = 5
Results and Discussion = 8
1. 2-D PAGE of Hemocyte Proteins = 8
2. 2-D PAGE of Plasma Proteins = 8
3. Identification of Hemocyte Protein = 8
4. Identification of Plasma Proteins = 9
Chapter Ⅱ. Proteomic analysis of Plutella xylostella larvae plasma parasitized by Cotecia plutellae, and characterization of pxSerpin 2 and TCTP = 28
Abstract = 29
Introduction = 31
Materials and Methods = 33
Results and Discussion = 41
1. 2-D PAGE of P. xylostella Plasma Proteins = 41
2. Identification of Parasitism-associated Proteins = 41
3. Quantitative Analysis of Parasitism-associated Proteins during Larval Development = 42
4. Sequence comparison of Serpins and spots 271, 272 = 50
5. Molecular cloning and mRNA expression profiles of pxSerpin 2 = 51
6. Total hemocytes counts (THC) of parasitized P. xylostella. = 53
7. Immunostaining of Apoptotic Hemocytes = 53
8. Morphological changes and immunocytochemistry of TCTP in parasitized P. xylostella larvae = 54
References = 83
Abstract in Korean = 91
