Reversal of hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic mice by transplantation of pancreatic hormone-expressing cells derived from human embryonic stem cells
- 주제(키워드) human embryonic stem cell , pancreatic hormone expressing cells , diabetes
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 김종훈
- 발행년도 2009
- 제출일 2009-01-09
- 학위수여년월 2009. 2
- 학위명 박사
- 학과 일반대학원 생명유전자원공학과
- 세부전공 동물생명유전공학 전공
- 원문페이지 180 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000007653
- 본문언어 영어
- 제출원본 000045532900
초록/요약
The capacity for self-renewal and pluripotency of human embryonic stem cells (hESCs) makes them a source for pancreatic β-cells. The present studies were conducted to differentiate hESCs into functional pancreatic-hormone producing cells and improve survival and function of intraportal transplanted encapsulated islets in vivo. In Chapter 1, investigation was performed on whether sequential exposure of hESCs to epigenetic signals that mimic in vivo pancreatic development can efficiently generate pancreatic endodermal cells, and whether these cells can be further matured and reverse hyperglycemia upon transplantation. Sequential treatment of serum, activin A, and retinoic acid (RA) highly upregulated the expression of forkhead box protein A2 (FOXA2), SRY-box containing gene 17 (SOX17), pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1) and homeobox HB9 (HLXB9). The population of pancreatic endodermal cells that produced PDX1 was significantly increased at the expense of ectodermal differentiation, and a subset of the PDX1-positive cells also produced FOXA2, caudal-type homeobox transcription factor 2 (CDX2), and nestin (NES). After transplantation, the PDX1-positive cells further differentiated into mature cell types producing insulin and glucagon, resulting in amelioration of hyperglycemia and weight loss in streptozotocin-treated diabetic mice. In Chapter 2, this study showed that pancreatic endodermal cells derived from hESCs can be efficiently differentiated to pancreatic hormone-expressing endocrine cells through a sequential exposure to epigenetic signals similar to those in pancreatic development. The sequential treatment of epigenetic signals highly upregulated the expression of pancreatic markers such as PDX1, INS, GCG, and SST, whereas, undifferentiated markers were down-regulated. After transplantation, differentiated cells were positive in pancreatic hormones expressions such as INS and GCG, resulting in amelioration of hyperglycemia and weight loss in streptozotocin-induced diabetic mice. In Chapter 3, microencapsulation of islets has been shown as a mean of preventing immune-destruction following transplantation. Capsule of diameter under 200 μm made with a microfluidic chip technology present many advantages, such as smaller total implant volume and accessibility to new transplantation sites. To date, encapsulated islet graft has usually been transplanted in the peritoneal cavity. This study investigates the feasibility of intraportal injection of 200 μm encapsulated islets in diabetic rats. In the diabetic rat which received alginate encapsulated islets, some of the islets survived up to over 2~3 weeks without injection of immunosuppressors. Taken together, the present studies demonstrate that hESCs differentiate into functional pancreatic hormone-expressing cells through a sequential exposure to epigenetic signals and that microencapsulation made with a microfluidic chip is applicable to ongoing improvement of islet transplantation for human diabetes.
more초록/요약
인간배아줄기세포는 인체를 구성하는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성을 소유한 세포이다. 인간배아줄기세포로부터의 췌장베타세포로의 분화는 당뇨병의 세포치료를 위한 새로운 췌도 공급원이 될 수 있다. 본 연구는 인간배아줄기세포를 기능성 췌장세포로 분화시켜 생체 내외에서 기능성을 검증하였고, 간문맥에 이식된 캡슐화된 췌도세포가 생체 내에서 생존하여 혈당을 강하시키는 효과를 확인하였다. 제 1장에서는 인간배아줄기세포를 중내배엽성 세포로의 분화를 촉진시키기 위하여 혈청을 처리하고, 연이은 진정내배엽성 세포로의 분화에 액티빈과 레티노익 산을 추가로 처리한 후 ITS배지에서 배양하여 췌장전구세포로의 분화 유도에 성공하였다. 추가적으로 생체 내에서 분화를 유도하여 당뇨모델의 혈당강하 효과를 확인하였다. 혈청과 액티빈, 레티노익 산의 처리는 FOXA2, SOX17, PDX1, HB9과 같은 췌장 전구세포의 표지인자의 발현을 증가시켰다. 또한 PDX1을 발현하는 세포군들은 FOXA2 및 CDX2, NES 등을 동시에 발현함으로 진정내배엽성 유래의 췌장전구세포 임을 확인할 수 있었다. PDX1을 발현하는 세포를 당뇨모델에 이식한 후, 인슐린과 글루카곤, 소마토스타틴과 같은 췌장 호르몬을 생성하는 최종 분화된 세포를 발견할 수 있었다. 제 2장에서는 정상 췌장 발달과정을 인간배아줄기세포의 분화단계에 적용하여 췌장 호르몬을 발현하는 내분비세포로의 분화를 유도하였다. 정상 췌장 발달과정의 도입을 통해서 최종 분화된 세포는 췌장 표지인자인 PDX1, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴의 발현이 증가된 반면 미분화 표지인자의 발현은 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한 배양액 내 글루코스 농도의 변화에 민감성을 나타내어 인슐린을 분비하는 능력을 보유함을 증명하였다. 분화세포를 이식한 후 당뇨모델의 혈당이 감소함을 확인할 수 있었고, 인슐린과 글루카곤과 같은 췌장 내분비세포 표지인자의 발현을 이식 조직에서 확인하였다. 제 3장에서는 췌도세포를 캡슐화하여 이식 후 면역반응을 회피할 수 있음을 보여준다. 기존의 캡슐화 방법은 캡슐 직경이 200 um를 초과하여 소동물의 간문맥 이식에 제한이 있었으나 본 연구에서는 미세유체 칩을 통해 직경 200 μm이하의 캡슐을 만들어 간문맥에 췌장소도세포를 이식 할 수 있는 기술을 적용하였다. 캡슐화되어 이식된 췌도세포는 2~3주간 면역억제제의 투여 없이 생체 내에서 생존하며 당뇨모델의 혈당강하 효과를 보였다. 결론적으로, 본 연구 결과를 통해 인간배아줄기세포가 정상 췌장 발달과정에서 분비되는 생체인자를 통해 효과적으로 췌장 내분비세포로 분화됨을 확인할 수 있었다. 생체 외에서뿐만 아니라 생체 내에서도 췌장세포로서의 능력을 보유함을 증명하였다. 또한 미세유체 칩을 통한 췌장소도세포의 캡슐화를 통해 간문맥에 이식가능하고 피이식체의 면역거부반응을 회피할 수 있는 가능성을 제시하였다.
more목차
Background = 1
Objectives = 6
CHAPTER Ⅰ. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate = 7
1. Introduction = 8
2. Materials and methods = 14
2.1 Cell culture and differentiation conditions = 14
2.2 Semiquantitative RT-PCR analysis = 15
2.3 Immunofluorescence staining = 17
2.4 Transplantation = 20
2.5 Statistical analysis = 20
3. Results = 21
3.1 Characterization of undifferentiated hESCs = 21
3.2 Differentiation of hESCs into endoderm and PDX1^(+) pancreatic endoderm = 24
3.3 Formation of cell clusters from PDX1^(+) endoderm = 35
3.4 Differentiation of PDX1^(+) endoderm into pancreatic cell types in vivo = 38
3.5 Multiple hESC lines produce PDX1^(+) pancreatic endoderm = 43
4. Discussion = 46
CHAPTER Ⅱ. Generation of functional pancreatic endocrine cells from human embryonic stem cell-derived definitive endoderm and reversal of hyperglycemia in an animal model of diabetes = 51
1. Introduction = 52
2. Materials and methods = 58
2.1 Cell culture and differentiation conditions = 58
2.2 RNA extraction and RT-PCR analysis = 59
2.3 Western blotting analysis = 61
2.4 Immunohistochemistry and dithizone staining = 61
2.5 Insulin content and secretion assay = 63
2.6 Flow cytometry = 63
2.7 Induction of diabetic animal model and kidney implantation of hESC- derived pancreatic endocrine cells = 64
2.8 Statistical analysis = 65
3. Results = 66
3.1 Differentiation of hESCs into definitive endodermal cells = 66
3.2 Directed pancreatic differentiation of hESCs = 71
3.3 Transplantation of differentiated cells rescues hyperglycemia in diabetic nude mice = 93
4. Discussion = 98
CHAPTER Ⅲ. Intraportal transplantation of alginate-encapsulated pancreatic islets in diabetic rats = 105
1. Introduction = 106
2. Materials and methods = 110
2.1 Islet isolation and graft recipients = 110
2.2 Microfluidic islet encapsulation chip production and microencapsulation = 111
2.3 Cell viability assessment = 113
2.4 Immunofluorescence and DTZ staining = 113
2.5 Insulin content and secretion assay = 114
2.6 Statistical analysis = 114
3. Results = 119
3.1 Effect of microencapsulation on rat islet viability in vitro = 119
3.2 Effect of microencapsulation on rat islet insulin production and secretion in vitro = 122
3.3 Transplantation of rat islets into diabetic SD rats = 127
4. Discussion = 134
Conclusion = 138
References = 140
국문초록 = 161
감사의 글 = 164
