Comparison of Antitumor Effects with Salmonella typhimurium Harboring Prokaryotic and Eukaryotic Vector Expressing TNF-α in Tumor Bearing Mice
- 주제(키워드) Salmonella typhimurium
- 발행기관 고려대학교 대학원
- 지도교수 박용근
- 발행년도 2009
- 제출일 2008-12-30
- 학위수여년월 2009. 2
- 학위명 석사
- 학과 생명공학과 생명공학과
- 세부전공 분자세포생물학 전공
- 원문페이지 57 p
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/korea/000000006847
- 본문언어 한국어
- 제출원본 000045533444
초록/요약
S.typhimurium은 통성 혐기성이며 세포 내 생장을 선호하는 세균으로 장티푸스열을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 S.typhimurium은 암세포에도 특이적으로 모여서 축적될 수 있으며, 원핵성과 진핵성 벡터 시스템을 통해 특정 단백질을 발현하여 항암효과를 유발 할 수 있음도 밝혀져 있다. 본 연구에서는 원핵성(Sal-proT)과 진핵성(Sal-euT) 벡터 시스템을 이용하여 TNF_(-α)를 발현하는 S.typhimurium의 항암효과를 나타내는 기전과 효능을 평가하고 마우스 피부암 모델에서의 항암 효과를 평가해 보고자 하였다. Sal-proT에서 Type III secretion systems(TTSSs)는 TNF_(-α) 단백질을 분비하게 하거나, 숙주 세포로 침투하여 감염시키는데 이용된다. 본 연구에서는 TNF_(-α)를 발현할 수 있는 단백질 분비 신호 서열로 Sip B 단백질 N-말단의 160 아미노산 서열을 이용하였으며 원핵성 프로모터 작동에 의한 벡터 시스템을 완성하였다. 다음으로 Sal-euT에서는 진핵성의 pcDNA3.0 벡터 플라스미드에 TNF_(-α) 서열을 붙여 완성하였다. Salmonella invasion assay를 통해 Sal-euT가 Sal-proT보다 피부암 세포에 대한 침투율이 더 높았음을 알 수 있었다. 세포독성 효과를 비교해 보았을 때는 Sal-proT가 Sal-euT보다 높게 나타났다. 종양을 지닌 마우스에서 암의 억제와 마우스 생존율에 있어서는 Sal-euT를 처리했을 때 보다 Sal-proT의 효과가 더 좋았음이 관찰되었다. 또한 재조합 플라스미드 안정성 실험을 통해 S.typhimurium내에서 재조합 된 플라스미드는 3일까지 유지됨을 알 수 있었고, Sal-proT와 Sal-euT를 주입한 마우스의 폐, 비장, 간, 신장조직 분석 결과 아무런 부작용도 발견되지 않았다. 그러나 Sal-proT와 Sal-euT를 처리하여 살아남은 마우스에 원래의 피부암을 재주입했을 때 마우스에서 면역반응을 유도하지 못함을 알 수 있었다. 본 연구는 Sal-proT와 Sal-euT가 마우스 피부암 모델에 항암 치료제로서 이용될 수 있다고 제안한다.
more초록/요약
Facultative anaerobic intracellular Salmonella typhimurium (S.typhimurium) has been as a tumoricidal agent because of their properties of tumor targeting and selective growth in tumor cells. Also, S.typhimurium causes typhoid fever like S.typhi in mice. In this study, we developed genetically engineered S.typhimurium expressing TNF_(-α) using prokaryotic(Sal-proT) and eukaryotic vector(Sal-euT). And then, we compared with efficacies of Sal-proT and Sal-euT as tumor therapeutic agents. Sal-proT uses type III protein secretion systems for expression of effector proteins. We used N-terminus 160 amino acid of Sip B protein for expression of TNF_(-α). We used eukaryotic pcDNA3.0 vector plasmid for making Sal-euT. In case of Salmonella invasion assay, it displayed that Sal-euT was higher invasion rates than Sal-proT. Sal-proT and Sal-euT exhibited with significant cytotoxic effects in tumor cells. When subcutaneously injected with Sal-proT and Sal-euT in lung, spleen, liver, kidney of mice it were not shown that any other side effects in histopathology analysis. In case of recombinant plasmid stability tests of Sal-proT and Sal-euT, the recombinant plasmid DNA maintained for three days in test-tube experiments. For comparison of anti-tumor effects, mice were subcutaneously injected of mouse B16F10 melanoma cells and treated with recombinant S.typhimurium strains on day 7 after tumor implantation. The results showed that Sal-proT was significantly inhibited tumor growth than Sal-euT. And Sal-proT showed that survival rates of mice were much longer than mice treated with Sal-euT, Sal-vec or S.typhimurium alone or PBS controls. Thus, Sal-proT was more efficient for tumor treatments in mice. But, both Sal-proT and Sal-euT were regarded as efficient antitumor agents against B16F10 mouse melanoma model. Finally, experiments about antitumor memory-based immune responses with Sal-proT and Sal-euT showed that these recombinant S.typhimurium strains couldn’t induce anti-tumor immunity. Although two recombinant strains have different modalities, taken together, these suggested that tumor-targeted bacterial therapies using of Sal-proT and Sal-euT considered as antitumor agents and prospective strategies.
more목차
서론 = 1
재료 및 방법 = 7
1. 균주와 생장 조건 = 7
2. 유전자 변형 = 7
3. 재조합 플라스미드 제조와 살모넬라로의 전환 = 7
4. 균체와 상층액으로부터의 단백질 추출 = 9
5. SDS-PAGE Western blotting = 10
6. 세포 생장 조건 = 11
7. Transfection = 11
8. Salmonella invasion assay = 12
9. 종양세포 독성 검사 = 13
10. 플라스미드 안정성 검사 = 13
11. 병리학적 조직검사 = 14
12. 종양세포 접종과 균주 처리조건 = 14
결과 = 16
S.typhimurium내의 재조합 플라스미드 제조 = 16
Sal-proT에서의 TNF-α 단백질 발현 = 17
Sal-euT에서의 GFP fusion 단백질 발현 = 17
Sal-proT와 Sal-euT의 종양세포로의 침투능과 효과 = 17
재조합 플라스미드 안정성 실험 = 18
Sal-proT와 Sal-euT를 처리한 마우스 장기의 부작용 = 18
Sal-proT와 Sal-euT의 종양억제 효과와 생존율 변화 = 19
Sal-proT와 Sal-euT의 항암효과와 면역 반응 = 19
고찰 = 33
참고문헌 = 36
ABSTRACT = 45
